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研究背景:骨肉瘤（osteosarcoma,OS）是儿童和青少年时期最常见的原发性恶性肿瘤,起源于间质细胞,恶性程度高,早期即可出现远处转移。目前骨肉瘤治疗采用的标准疗法为“新辅助化疗+手术+术后化疗”,但由于化疗耐药的问题导致疗效不佳。因此,深入研究骨肉瘤化疗耐药及其分子机制对骨肉瘤的治疗和预后具有重要意义。随着研究深入,越来越多的研究证据表明骨肉瘤细胞对化疗药物的敏感性与Lnc RNA密切相关。此外,铁死亡（Ferroptosis）作为一种最近广泛研究的细胞死亡形式,在肿瘤耐药中起着重要作用。本研究将聚焦于Lnc RNA SNHG14在骨肉瘤细胞耐药中的作用及其分子机制,并探讨铁死亡与细胞耐药性之间的联系,以期为逆转化疗耐药提供新思路。目的:明确Lnc RNA SNHG14在骨肉瘤细胞Nutlin3a耐药中的作用及其分子机制;探明铁死亡与细胞耐药性之间的联系。方法:1.通过生物信息学分析富集长链非编码RNAs:应用Ensemble数据库进行预测,得到可能与骨肉瘤化疗耐药相关的Lnc RNAs,并通过real time PCR进一步验证。2.构建p SEH-361-si SNHG14质粒,将其包装为逆转录病毒并感染骨肉瘤Nutlin3a耐药细胞（n19-SJSA1细胞）,通过real time PCR检测Lnc RNA SNHG14 knockdown的效果。3.检测Lnc RNA SNHG14 knockdown对骨肉瘤细胞铁死亡、耐药的作用及二者间的关系:（1）通过结晶紫染色、MTT等方法检测Lnc RNA SNHG14 knockdown后n19-SJSA1细胞的存活率。（2）通过real time PCR、western blot检测Lnc RNA SNHG14 knockdown后n19-SJSA1细胞铁死亡相关基因的表达水平;荧光染色、流式细胞术检测铁死亡脂质过氧化过程中ROS、Lip ROS的产生水平;MDA试剂盒检测脂质过氧化产物丙二醛的含量;铁离子试剂盒检测铁离子的浓度。（3）在Lnc RNA SNHG14 knockdown的基础上加入铁死亡抑制剂Ferrostatin-1,应用上述方法检测骨肉瘤细胞铁死亡及耐药性的变化。4.探索Lnc RNA SNHG14 knockdown介导的铁死亡逆转骨肉瘤细胞Nutlin3a耐药的具体分子机制:（1）公共数据库以及RNA FISH实验确定Lnc RNA SNHG14的亚细胞定位,预测下游靶向的mi RNA,并通过双荧光素酶报告基因实验验证。（2）进行Lnc RNA SNHG14 knockdown并抑制mi R-206表达后,检测骨肉瘤细胞对Nutlin3a的敏感性以及铁死亡相关指标。（3）预测mi R-206下游靶基因并进行双荧光素酶报告基因实验验证。（4）mi R-206 inhibitor、si SLC7A11共转染后,检测n19-SJSA1骨肉瘤细胞铁死亡相关指标。结果:1.通过生物信息学预测并结合real time PCR的分析筛选出可能与骨肉瘤细胞Nutlin3a耐药密切相关的Lnc RNA—Lnc RNA SNHG14。2.成功构建靶向Lnc RNA SNHG14的p SEH-361-si SNHG14逆转录病毒质粒,将其包装为逆转录病毒并感染骨肉瘤耐药的n19-SJSA1细胞。3.（1）Lnc RNA SNHG14 knockdown后骨肉瘤细胞对Nutlin3a药物敏感性上升,具体表现为:SLC7A11、GPX4等铁死亡关键抑制分子以及Nrf2、HO-1等抗氧化分子m RNA以及蛋白表达水平降低,而Keap1和Ptgs2等诱导氧化应激分子的表达水平升高;ROS、Lip ROS的水平升高,MDA含量以及铁离子浓度也显著升高。以上实验表明Lnc RNA SNHG14 knockdown可诱导n19-SJSA1耐药细胞的铁死亡。（2）在Lnc RNA SNHG14 knockdown的基础上加入铁死亡抑制剂Ferrostatin-1后,SLC7A11、GPX4、Nrf2、HO-1 m RNA以及蛋白表达升高,Ptgs2、Keap1 m RNA以及蛋白表达降低;ROS、Lip ROS的水平以及MDA含量、铁离子浓度下降;骨肉瘤耐药细胞对Nutlin3a的敏感性下降。以上结果说明Lnc RNA SNHG14 knockdown所引起的Nutlin3a药物增敏作用是通过铁死亡实现的。4.（1）公共数据库以及RNA FISH实验验证Lnc RNA SNHG14的亚细胞定位在胞质,生物信息学预测并通过real time PCR筛选出下游靶基因—mi R-206,进一步双荧光素酶报告基因实验检测发现Lnc RNA SNHG14可靶向结合mi R-206。（2）在Lnc RNA SNHG14 knockdown基础上抑制mi R-206表达后,骨肉瘤耐药细胞对Nutlin3a药物敏感性明显降低;细胞表现出与加入铁死亡抑制剂同样的现象,表明Lnc RNA SNHG14 knockdown激活n19-SJSA1细胞的铁死亡是通过靶向mi R-206实现的。（3）生物信息学预测并通过real time PCR筛选出mi R-206的靶基因—SLC7A11,进一步双荧光素酶报告基因实验检测结果显示mi R-206可靶向结合SLC7A11。（4）mi R-206 inhibitor、si SLC7A11共转染后,铁死亡抑制分子的表达明显下降,Keap1、Ptgs2表达明显上升;ROS、lip ROS、MDA含量以及铁离子浓度上升。上述结果表明:Lnc RNA SNHG14通过靶向mi R-206而上调SLC7A11的表达,进而抑制铁死亡以促进骨肉瘤细胞对Nutlin3a化疗耐药。结论:1.铁死亡是骨肉瘤细胞产生耐药的重要环节;Lnc RNA SNHG14是通过抑制铁死亡从而促使骨肉瘤细胞对Nutlin3a产生耐药。2.mi R-206是骨肉瘤细胞产生耐药的重要分子;Lnc RNA SNHG14是通过靶向mi R-206从而抑制铁死亡。3.SLC7A11是骨肉瘤细胞耐药与铁死亡交联的关键分子;Lnc RNA SNHG14通过靶向mi R-206而上调SLC7A11的表达,进而抑制铁死亡以促进骨肉瘤细胞对Nutlin3a产生耐药。本研究对骨肉瘤耐药的临床防治提出了新的思路并奠定了前期实验基础。