背景与目的肾癌是泌尿系最常见的肿瘤之一,在泌尿系肿瘤中位居第二,具有组织多样性,发病机制尚不清楚,肾癌恶性程度高,不易早期发现,确诊时约35%的患者已有转移,2年死亡率高达95%,约40%患者术后转移或复发,3年存活率小于5%.肾癌一旦出现淋巴转移,即使行根治性淋巴结清扫,患者生存期也极少超过5年,由于肾癌先天性对放疗、化疗都不敏感,放疗、化疗不作为常规辅助治疗。近年来晚期肾癌的生物治疗,靶向治疗取得了一定的成绩,但疗效仍很有限,有待进一步提高。随着诊断手段,外科技术的日臻完善,肾癌的预后有一定的改善,但复发、转移仍是威胁患者生命的主要因素,因此转移性肾癌的防治是目前研究工作的重点,热点,迫切需要寻找新的治疗方案。众所周知转移是恶性肿瘤患者死亡的主要原因,大约90%的恶性肿瘤患者死于肿瘤转移,肿瘤转移是恶性肿瘤的特征性生物学之一,也是导致肿瘤预后差的主要原因,其中肿瘤细胞本身的运动能力的增强是导致肿瘤侵袭性生长和迁移的前提,任何参与改变细胞运动能力的分子都可能成为肿瘤转移的关键分子,肌动蛋白表达量及其空间排布是引起细胞运动改变的直接原因,引起肌动蛋白表达、分布、改变涉及细胞内外诸多因素,其中膜细胞骨架蛋白-ezrin（埃兹蛋白）为关键分子,ezrin作为ERM（ezrin radixin moesin）蛋白家族成员,是一种胞膜与细胞骨架的联接蛋白,是将胞外信号传递到细胞的重要联系分子,近年来研究证明ezrin参与多种肿瘤细胞的运动转移,在肿瘤发展、浸润、转移过程中起关键作用,有关ezrin在肾癌中的研究目前国内外尚未见报道。研究目的:1.从蛋白和基因水平观察人肾癌组织中ezrin的表达及其与肾癌临床病理特征的关系;2.构建人ezrin基因短发夹状小干扰RAN的质粒载体,采用RNA干扰技术沉默人肾癌细胞系786-0细胞中ezrin基因表达,观察干扰前后786-0细胞生物学性状改变,一方面进一步明确ezrin在肾癌发生发展中的作用,另一方面探讨利用RNA干扰技术作为肾癌基因治疗的策略和方法。材料和方法一膜细胞骨架蛋白-ezrin在人肾癌组织中表达及其临床意义。1.对80例肾癌组织和40例癌旁正常肾组织行组织芯片制作及免疫组化染色检测;结果判断:ezrin阳性表达在肾癌细胞膜和胞浆内,呈棕黄色颗粒;半定量分析:组织切片免疫组化染色评估由同一位病理医师完成,按染色强度和阳性表达细胞数,按照参考文的评分标准,对每张切片进行评分,无染色:0分,染色较弱:1分,中等强度:2分,强染色:3分;按每个视野中阳性细胞百分数评分,未见阳性细胞:0分,阳性细胞1%-24%:1分,阳性细胞25%-49%:2分,阳性细胞50%-74%:3分,阳性细胞超过75%:4分。以上两种评分相乘为最终分数,按本评分系统,最高分为12,最低为零。2.根据有无淋巴结转移,腔静脉瘤栓形成分为:单纯肾癌组织（无淋巴结转移,无腔静脉瘤栓形成）,癌旁正常肾组织,伴有淋巴结转移肾癌组织,伴有腔静脉瘤栓形成肾癌组织。每组随机取10例行RT-PCR和Western blot测定各组ezrin mRNA及ezrin蛋白相对表达量。二.人ezrin基因短发夹状RNA质粒载体构建、制备及筛选。1.短发夹状小干扰RNA的模板寡核苷酸链的设计与合成:从gene bank中搜索ezrin基因序列（NM₀03379.4 GI:161702984）应用Ambion在线RNAi设计软件,设计2对siRNA s（small interference RNAs）,确定并合成两端分别带有BamⅢ和HindⅢ酶切位点shRNAs（short hairpin RNAs）单链,退火复性合成双链,BamHI和HindⅢ酶切载体pGenesil-1,连接退火复性产物,酶切后载体内含不同ezrin基因特异性序列的寡核苷酸干扰片断（shRNA-ezrinl,shRNA-ezrin2）,另设计通用阴性pGenesil-1-HK。2.重组质粒的双酶切鉴定和测序分析,重组质粒转化大肠杆菌及大量质粒提取。3.shRNA功能鉴定:常规细胞培养,待人肾癌细胞系786-0细胞达80-100%融合时,进行传代,传至第三代时用脂质体lipofectamin ^TM2000转染;786-0细胞分别用两个重组质粒,阴性对照质粒转染,另设未转染组为空白对照,即分别为:shRNA-ezrin1,shRNA-ezrin2,shRNA-HK,blank组;于转染后24h在荧光倒置显微镜下观察转染效率,根据绿色荧光蛋白（green fluorescent proteinGFP）表达后发绿色荧光的特征,在荧光显微镜下观察GFP的表达情况,计算出质粒转染效率,质粒转染效率=每高倍镜视野发荧光细胞数/同一视野细胞总数×100%。三.RNA干扰技术抑制ezrin表达对人肾癌细胞系786-0细胞增殖、凋亡及侵袭性的影响。1.shRNA干扰效率的检测:①实验分组:未转染组（blank）、阴性质粒转染组（HK）、shRNA-ezrin1转染组、shRNA-ezrin2转染组;以每孔200ul（5×10³）个细胞接种于96孔培养板中,将培养板移入CO2孵箱中,在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下常规培养。②运用荧光定量PCR检测质粒转染后48小时各组ezrin mRNA表达;用相对定量数据分析:以2^-△△t（Ct代表循环阈值）表示基因的表达量,平均相对含量=2^{-average△△CT}×100%,干扰效率=(1-2^{-average△△CT})×100%,公式:△△Ct={Ct（ezrin）-Ct（β-actin）}干扰细胞-{Ct（ezrin）-Ct（β-actin）}对照（未转染细胞）。③Western Blot检测ezrin蛋白的表达,分别检测转染后24h和72h各组ezrin蛋白相对含量。2.MTT检测细胞增殖活性:分别于转染后1、2、3、4、5、6、7天时收集各组细胞,每组6孔;在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值（A值）,比较各组细胞的增殖情况。3.透射电镜检测786-0细胞凋亡:收集转染后72h shRNA-ezrin1转染组786-6细胞和对照组细胞（未转染）,按照投射电镜制片步骤制片,最后在不同倍数下用JEM-2000EX投射电镜观察转染前后人肾癌细胞系786-0细胞超微结构。4.流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞增殖周期:以亚G₁峰的细胞数占观察细胞分数为细胞凋亡的检测指标,细胞增殖指数（PI prol i feration index）为PI=[S+G₂/M]/[G₀/G₁+S+G₂/M]。5.细胞同质粘附实验:观察RNAi干扰ezrin表达对人肾癌细胞系786-0细胞粘附性的改变。6.趋化运动实验:观察RNAi干扰ezrin表达对人肾癌细胞系786-0细胞运动及穿孔能力的影响。7.软琼脂糖克隆形成实验:观察RNAi干扰ezrin表达对人肾癌细胞系786-0细胞锚着独立生长能力的影响。结果1.ezrin蛋白的表达定位于胞浆和胞膜,ezrin蛋白阳性表达率肾癌组织中为95%（76/80）,高于癌旁正常肾组织75%（30/40）（x²=8.501 P=0.004）。免疫组化评分淋巴结转移组（9.04±1.37）分,高于无淋巴结转移组（7.45±1.75）分（t=4.385,P<0.001）;腔静脉瘤栓组（9.00±1.79）分,高于无腔静脉瘤栓组（7.63±2.03）分（t=2.480,P=-0.015）;免疫组化评分与患者的性别、年龄、肿瘤分期、分级及临床病理类型及肿瘤大小差异无统计学意义（p>0.05）。2.各组ezrin mRNA均有表达,且组间差异有统计学意义（F=30.247,P<0.001）;与癌旁正常肾组织相比,单纯肾癌组织,淋巴结转移肾癌组织,腔静脉瘤栓形成肾癌组织ezrin mRNA相对表达量增加（P<0.001）;与单纯肾癌组织相比,淋巴结转移肾癌组织,腔静脉瘤栓形成肾癌组织ezrin mRNA相对表达量增加（P<0.001）;淋巴结转移肾癌组织与腔静脉瘤栓形成肾癌组织间差异无统计学意义（P=-0.318）。3.Western Blot检测结果表明:ezrin蛋白表达各组间差异有统计学意义（F=14.210,P<0.001）;肾癌组织及癌旁正常肾组织中均有表达,单纯肾癌组织表达水平高于癌旁正常肾组织（P=0.014）;淋巴结转移及腔静脉瘤栓形成肾癌组织表达高于单纯肾癌组织（P=0.015,P=0.002）,瘤栓形成组与淋巴结转移组间差异无统计学意义（P=0.462）。4.经酶切鉴定分析,质粒p-shRNA-ezrin1,p-shRNA-ezrin2均符合设计要求。5.重组质粒的测序分析:DNA测序结果显示插入片断与设计DNA片断完全一致。6.转染效率测定:于转染后24h在荧光倒置显微镜下观察, shRNA-ezrin1,shRNA-ezrin2,shRNA-HK细胞中均有较大比例的细胞表达绿色荧光蛋白,shRNA-ezrin1,shRNA-ezrin2,shRNA-HK,24h后转染效率（%）分别为:82.600±0.078,80.567±0.090,82.758±0.505,各组转染效率无显著差异（F=0.160,P=0.853）。7.荧光定量PCR结果表明:质粒转染48h后,各组中均有不同程度的ezrin基因扩增,溶解曲线未见有杂峰;p-shRNA-0（未转染组）,p-shRNA-HK（阴性质粒转染组）,p-shRNA-1（shRNA-ezrin1转染）,p-shRNA-2（shRNA-ezrin1转染）的ezrin mRNA相对表达量分别为100%,94.61%,33.45%,47.63%,shRNA-ezrin1的干扰效率高达66.55%。8.Western Blot分析显示:质粒转染24h后各组间ezrin蛋白的相对表达量无显著性差异（F=0.793,P=0.512）;72h后各组间ezrin蛋白的相对表达量有显著性差异（F=11.549,P<0.001）,干扰后shRNA-ezrin1,shRNA-ezrin2组ezrin蛋白表达量明显下降;其中shRNA-ezrin1与p-shRNA-0,p-shRNA-HK组比较（P<0.05）,shRNA-ezrin2与p-shRNA-0,p-shRNA-HK组比较（P<0.05）,shRNA-ezrin1与shRNA-ezrin2比较（P=0.034）,shRNA-HK与未转染组比较（P=0.430）。9.RNA干扰对786-0细胞生物学行为影响（1）MTT法检测结果表明:经析因方差分析,结果显示组别间差异有显著性（F=92.053,P<0.000）,不同时间水平间差异有统计学意义（F=300.078。P<0.000）,组别与时间之间有交互作用（F=18.356,P<0.000）。进一步分析单独效应,结果显示在固定组别条件下,各时间点差异有统计学意义（P均P<0.001）,在固定时间因素条件下,从第3天开始各组间差异有统计学意义（P均P<0.01）,提示Si-ezinl和Si-ezin2均有较好干扰效果,且Si-ezinl质粒载体干扰效果优于Si-ezin2质粒载体。（2）透射电镜观察:shRNA-ezrin1重组质粒转染后786-0细胞有明显核浓缩,核边集,和碎裂现象,未转染786-0细胞未见到明显凋亡现象。（3）流式细胞仪检测结果:未转染组、阴性质粒转染组G-（?）/G₁细胞峰前未出现明显凋亡峰-Sub-G₁峰,shRNA-ezrin1组与shRNA-ezrin2组G_?/G₁期细胞峰前均出现凋亡峰,与未转染及阴性质粒转染组相比shRNA-ezrin组转染后,G₀/G₁时段明显延长（P<0.01）,PI缩短（P<0.01）,细胞凋亡率增加（P<0.01）。（4）细胞同质黏附实验:未转染组和阴性质粒转染组同质粘附细胞数明显多于p-shRNA-ezrin1质粒转染组（P<0.01）。（5）细胞趋化运动:未转染组和阴性质粒转染组穿孔细胞数明显多于p-shRNA-ezrin1质粒转染组（P<0.001）。（6）软琼脂糖克隆形成实验:与未转染组和阴性质粒转染组相比p-shRNA-ezrinl质粒转染组体外双层琼脂糖集落形成减少（p<0.01）结论1.膜细胞骨架蛋白-ezrin在人肾细胞癌组织中高表达,表达水平明显高于癌旁正常肾组织。2.ezrin蛋白在肾癌中表达程度与患者年龄、性别、临床病理分期、分级及病理分型及肿瘤大小无关,与有无淋巴结转移、是否有腔静脉瘤栓形成密切相关,有淋巴结转移和腔静脉瘤栓形成的肾癌组织显著高于无淋巴结转移和腔静脉瘤栓形成的肾癌组织。3.选择ezrin基因编码区序列,运用含U6启动子的转录载体p-genesil-1成功的构建了两条具有短发夹结构的小干扰RNA重组质粒。4.在体外重组质粒转染人肾癌细胞系786-0细胞,经荧光定量PCR和WesternBlot检测,两条重组质粒载体能有效抑制786-0细胞中ezrin mRNA和蛋白表达,两条shRNA干扰效率分别66.55%和52.37%。5.选用抑制效率较高的一条（基因位点344-363）转染人肾癌细胞系786-0细胞,发现shRNA干扰后786-0细胞增殖活性减弱,G₀/G₁期细胞数比率增加,细胞凋亡率增加,细胞粘附能力和侵袭力减弱。6.膜细胞骨架蛋白-ezrin可能与肾癌发生、增殖、侵袭密切相关;ezrin-siRNA能有效抑制肾癌ezrin基因表达,进而抑制肾癌的增殖、降低细胞粘附和侵袭能力,在诱导肿瘤细胞凋亡中亦发挥重要作用,提示RNAi有望成为肾癌基因治疗的有效手段。