通过开展干细胞生物学特性及诱导分化研究不仅可以丰富以干细胞形式保存遗传资源的内容，而且为保存的干细胞提供新的利用方向。利用增殖能力强的肺间充质干细胞(PMSCs)离体大量增殖和分化为功能性的肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)，是解决呼吸系统疾病的可行途径之一。目前，传统的过表达基因的方法可以调控细胞分化命运，但操作繁琐，难以控制基因表达水平，导致分化后功能性细胞的临床应用受限，而CRISPR/Cas9技术为细胞分化提供了新思路。本研究建立了五指山小型猪、小尾寒羊、鹅胚PMSCs和胎羊软骨干细胞(CSPCs)培养体系，鉴定其生物学特性和多分化潜能，并以分离的猪PMSCs为研究对象，利用CRISPR/Cas9介导的基因激活系统诱导其向功能性细胞ATⅡ分化，并研究分化的ATⅡ对肺损伤实验动物模型的修复效果，鉴定其功能效应及用于移植治疗的可行性。主要研究内容如下:　　1、胎猪、胎羊、鹅胚的PMSCs和胎羊CSPCs培养体系的创建与鉴定。利用酶消化法分离的胎猪、胎羊、鹅胚的PMSCs和胎羊CSPCs，可在体外扩增培养，形态多呈长梭形，免疫组化、RT-PCR和流式细胞术检测结果表明PMSCs表达间充质相关的表面标记物CD29、CD44、CD71、CD73、CD90和CD105。CSPCs表达CD29、CD166、ITGB1、ALCAM、FGFR3、COL1A2和SOX9表面抗原。生长曲线和克隆形成能力检测发现体外分离纯化后的细胞具有良好的自我更新与增殖能力。另外，此四种类型的细胞均具有多向分化潜能，能诱导分化为中胚层来源的成骨、软骨和脂肪细胞及其他胚层来源的细胞。　　2、猪PMSCs诱导分化为功能性ATⅡ细胞的诱导分化研究。三种诱导结果表明，相比于SAGM或者PneumaCultTM-ALI Medium诱导，CRISPR/Cas9介导的基因激活系统能更加有效的诱导猪PMSCs向ATⅡ分化。通过Mogrify软件预测功能性转录因子并运用q-PCR逐步筛选后发现，dCas9N-VPR系统和sgRNA共同作用激活转录因子GATA6、HOXA5和NR2F1的表达后，进行Western blot和q-PCR检测，它能进一步促进pro-SPC蛋白与SPC、SPB mRNA表达水平的上调。流式细胞仪分析表明，CRISPR/Cas9介导的基因激活系统能明显提高猪PMSCs诱导分化的效率。对分化后的细胞进行形态学观察发现呈现铺路石样的类上皮细胞形态。通过免疫荧光分析，分化细胞能表达ATⅡ的特异性标记物SFTPC、SPC和SPB。透射电镜观察发现，分化后细胞中呈现ATⅡ的特征性细胞器板层小体。　　3、猪PMSCs与诱导后的ATⅡ移植修复肺损伤实验动物模型研究。通过气管输注博来霉素后，引起小鼠肺组织损伤，具体表现为炎症和纤维化，尾静脉分别移植猪PMSCs和诱导分化后的ATⅡ，发现两种细胞均可以在肺内分化成肺泡Ⅰ型上皮细胞，并有效的参与肺损伤的修复。猪PMSCs移植治疗组与ATⅡ移植治疗组相比，后者能更好的改善和减轻小鼠肺损伤，肺组织中羟脯氨酸沉积量明显下降，肺纤维化程度明显减轻，缓解肺泡炎症和肺纤维化效果较好，小鼠存活率增加，体重能恢复到原有体重的95％。　　综上所述，本研究成功鉴定了不同畜禽来源的PMSCs和CSPCs的多向分化潜能，以及利用CRISPR介导的基因激活系统成功实现了猪PMSCs向ATⅡ的定向分化，并通过标志物鉴定以及动物模型实验证实了诱导细胞是功能性细胞，为肺损伤修复提供实验依据。这种直接调控特定内源基因以实现细胞分化的研究为细胞重编程技术提供了一个更加简单和安全的研究工具。