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维生素B6(VB6)是一类吡啶类化合物的总称,有吡哆醇(Pyridoxine,PN)、吡哆醛(Pyridoxal,PL)、吡哆胺(Pyridoxamine,PM)、磷酸吡哆醇(Pyridoxine-5’-phosphate,PNP)、磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate,PLP)和磷酸吡哆胺(Pyridoxamine-5’-phosphate,PMP)这六种形式,它们可以相互转换。其中PLP是VB6的主要辅酶形式,催化氨基酸的代谢反应。PLP含有一个强活泼性的醛基,极易与胺基结合形成醛亚胺,这可能会导致生物体内物质的紊乱。在生物体内,受磷酸酶的作用,体内游离的PLP浓度通常维持在一个较低的水平。 PLP的水解是控制细胞内游离PLP水平的一个重要机制。微生物和哺乳动物体内PLP水解的研究较为清楚,受到非特异性酸性磷酸酶和碱性磷酸酶的作用,同时存在特异性PLP磷酸酶。植物体内PLP水解机制的研究起步较晚,发挥作用的酶有待明确。本实验以豆芽为实验材料,PLP为底物进行纯化,可能得到特异性的PLP磷酸酶。同时以通用型底物pNPP(p-Nitrophenylphosphate)为底物进行纯化,得到的为普通的磷酸酶。对两种底物纯化出的酶进行比较,以确定豆芽中水解PLP的磷酸酶是否是特异性的磷酸酶。 以PLP为底物纯化出的酶最适pH为5.5,Mg2+、Zn2+和Mn2+对该酶有激活作用,其中Mg2+作用最强,氟化物和钼酸盐对其活性有抑制作用。在最适反应条件下,测得反应底物PLP和pNPP的Km值为0.27mmol/L和0.14mmol/L,该酶并未对PLP表现出很强的亲和力。 以pNPP为底物纯化出的酶最适pH为5.5,Mg2+、Zn2+和Mn2+对该酶有激活作用,其中Mg2+作用最强。氟化物和钼酸盐对其活性也有抑制作用,该酶对多种磷酸酯型底物都表现出较强的活性,在最适反应条件下,测得反应底物PLP和pNPP的Km值为0.18mmol/L和0.16mmol/L。 通过酶学性质比较,以PLP为底物纯化出的磷酸酶和以pNPP为底物纯化出的磷酸酶酶学性质相似。以PLP为底物纯化出的磷酸酶对底物PLP并未表现出很强的亲和力,对磷酸酯型的底物均有一定的催化活性。酶学性质比较结果表明豆芽中水解PLP的磷酸酶为非特异性的磷酸酶。