背景糖尿病时,心肌微血管损伤往往发生在大血管及心肌细胞损伤之前,是糖尿病心肌结构与功能障碍的重要始发因素之一,也是导致糖尿病心血管并发症和糖尿病患者高死亡率的重要因素。糖尿病患者由于高血糖及AGEs等代谢异常产物积聚所诱导的内质网应激在心肌微血管损伤的病理生理机制中具有重要作用。研究发现,内质网应激感受激酶-1α（inositol requiring enzyme-1α,IRE1α）及其下游信号可参与调控糖尿病诱导的心肌微血管损伤。如,IRE1α可以通过下调VE-cadherin等黏附因子的表达来破坏脑微血管渗透功能。而且,IRE1α的活化还可以通过诱导其下游p38、JNK通路的激活促发微血管内皮细胞凋亡,加重微血管损伤和微血管数目的减少,导致心肌组织微循环障碍。但是,在糖尿病心肌微血管损伤发展进程中,调控内质网应激感受激酶IRE1α及其下游信号激活的分子机制尚未完全阐明。已有研究报道,糖尿病代谢稳态破坏所产生的AGEs、Hsp60、Hsp70等可作为Toll样受体（toll like receptors,TLRs）的内源性配体,促发TLRs介导的细胞内信号转导,并与内质网感受激酶IRE1α及其下游信号的激活密切相关。而且,TLRs介导的细胞内信号转导激活时可上调Peli1并激活其E3泛素连接酶活性,Peli1则可进一步反馈调控TLRs介导的细胞内信号转导。尤其是,Peli1可以促进TRAF6发生泛素化,而TRAF6又可以直接抑制IRE1α的磷酸化水平,上述研究提示,在糖尿病发展过程中Peli1可能参与IRE1α及其下游信号激活的调控。然而,Peli1是否可能在糖尿病心肌微血管损伤的发生发展中发挥重要作用?特别是,内皮细胞Peli1在其中的调控作用是什么?其机制是否与调控内质网应激感受激酶IRE1α及其下游信号相关?内皮中Peli1是如何调控IRE1α及其下游通路?上述问题均有待阐明。为此,本研究拟着重围绕上述问题探讨Peli1在糖尿病心肌微血管损伤中的调控作用。目的1.明确血管内皮细胞Peli1在糖尿病心肌微血管损伤发生发展中的调控作用。2.阐明Peli1对糖尿病心肌微血管损伤的调控作用是否与其对内质网应激感受激酶IRE1α及其下游信号的调控密切相关。3.揭示AGEs是否可通过Peli1影响IRE1α及其下游信号对心肌微血管内皮细胞的损伤作用,并着重阐明Peli1调控IRE1α及其下游信号的分子机制。方法1.动物的在体实验采用STZ诱导糖尿病复制糖尿病心肌微血管损伤模型,观察在糖尿病发展进程中心肌微血管内皮细胞Peli1表达水平的变化。为明确内皮细胞中Peli1的作用,构建内皮细胞条件性敲除Peli1小鼠（Peli1ΔEC）,采用6-8周PeliF/F及Peli1ΔEC雄性小鼠,随机分为4组,组别设置为:PeliF/F 组、PeliF/F+STZ 组、Peli1ΔEC 组以及 Peli1ΔEC+STZ 组。分别观察在糖尿病发生8周时PeliF/F及Peli1ΔEC小鼠中给予STZ或柠檬酸缓冲液后对糖尿病心肌微血管损伤的改善作用以及在糖尿病发生16周时对心肌重塑、心功能的影响情况。2.体外细胞实验心肌微血管内皮细胞（Cardiac micro vascular endothelial cells,CMECs）的凋亡的增加、细胞间连接蛋白的减少、血管再生障碍等均是导致微血管功能受损的主要原因。在长期糖尿病条件下,可导致糖基化终末产物（advanced glycation end products,AGEs）大量的聚积,从而诱导CMECs功能发生改变。因此,本研究采用AGEs诱导CMECs复制体心肌微血管内皮细胞损伤模型。同时本研究通过转染腺病毒包装的Peli1干扰质粒（adv-shPeli1）抑制CMECs中Peli1的表达,给予AGEs诱导前分别转染adv-shPeli1或空载（adv-Scr）48小时。实验分组为:control、AGEs、adv-shPeli1+AGEs 以及 adv-Scr+AGEs。着重从以下几方面来进行探讨:①干扰CMECs中Peli1表达对内皮损伤的保护作用;②干扰CMECs中Peli1表达对IRE1α磷酸化的抑制作用;③Peli1调控IRE1α磷酸化的具体分子机制。3.观测指标磁珠分选法对正常及STZ诱导糖尿病小鼠的内皮细胞进行分离,并通过western blot法检测STZ诱导糖尿病小鼠的内皮细胞中Peli1表达情况;通过扫描电镜检测微血管完整性水平;透射电镜观察微血管的渗透功能;免疫荧光法检测微血管数目的变化情况;采用WGA染色及HE染色观察心肌细胞大小;天狼猩红染色观察血管周及间质胶原沉积情况;通过多普勒超声评估小鼠心脏收缩、舒张功能。采用qRT-PCR法检测内皮细胞中连接分子的mRNA水平;血管成管实验观察CMECs的成管能力;共培养实验检测CMECs对CFs释放Ⅰ、Ⅲ型胶原的影响;流式法观察CMECs的凋亡水平,采用caspase12/3酶活性检测试剂盒观察CMECs的凋亡程度,以及western blot法检测cleaved-caspase12/3的释放情况;通过western blot法观察内质网应激指示蛋白IRE1α磷酸化、PERK磷酸化以及ATF6的活化;采用免疫共沉淀法检测IRE1α与TRAF2的结合;western blot法观察IRE1α磷酸化介导的下游信号p38、JNK磷酸化水平;免疫荧光检测p-IRE1α在微血管上的活化情况;磁珠分选法检测Peli1F/F、Peli1F/F+STZ、Peli1ΔEC、Peli1 ΔEC+STZ四组内皮细胞中IRE1α及其下游p38的磷酸化水平;TUNEL染色了解心肌微血管凋亡情况;质谱法分析与Peli1相结合蛋白;蛋白动力学模拟Hsp90与Peli1蛋白的可能结合位点;免疫共沉淀实验检测内源性及外源性Hsp90与Peli1的结合;western blot检测Peli1介导的IRE1α磷酸化激活是否依赖于Hsp90。结果一、内皮细胞Peli1调控内质网应激感受激酶IRE1α及其下游信号在糖尿病心肌微血管损伤中的影响及机制研究1.STZ诱导糖尿病8周时,心肌微血管内皮细胞中Peli1表达显著升高,且心脏组织中AGEs的表达明显增加;与此同时扫描电镜发现STZ诱导Peli1F/F糖尿病小鼠微血管表面完整性遭到破坏;透射电镜显示有硝酸镧的渗漏,说明微血管的渗透功能发生改变;免疫荧光也显示微血管数目明显降低,以上结果均提示,STZ诱导糖尿病8周时,心肌微血管损伤发生。而在内皮细胞条件性敲除Peli1后可以明显保护微血管完整性、恢复微血管渗透功能、上调微血管数目,提示内皮细胞条件性敲除Peli1可以改善糖尿病诱导的心肌微血管损伤。2.STZ诱导糖尿病16周时,WGA染色及HE染色发现Peli1F/F小鼠心肌细胞显著增大;天狼猩红染色显示Peli1F/F小鼠血管周及间质胶原明显沉积;同时多普勒超声心动图显示Peli1F/F小鼠心脏收缩及舒张功能显著降低。而在STZ诱导的Peli1ΔEC小鼠中则可以明显改善上述指标,提示内皮细胞条件性敲除Peli1可以改善糖尿病诱导的心肌重构,恢复心功能。3.磁珠分选 STZ 诱导糖尿病 8 周的 Peli1F/F,Peli1F/F+STZ,Peli1ΔEC,Peli1 ΔEC+STZ四组小鼠的内皮细胞,western blot法发现STZ诱导糖尿病8周的Peli1F/F组小鼠内皮细胞中IRE1α及其下游p38、JNK的磷酸化水平显著增加。TUNEL染色结果显示Peli1F/F糖尿病小鼠内皮细胞明显凋亡。免疫荧光发现微血管中IRE1α磷酸化水平升高。而在STZ诱导的Peli1ΔEC小鼠内皮细胞中IRE1α及其下游p38、JNK的磷酸化水平明显下降,内皮细胞凋亡也明显减少。二、Peli1通过Hsp90调控IRE1α及其下游信号介导AGEs诱导的心肌微血管内皮细胞损伤1.AGEs诱导CMECs后Peli1表达显著升高;与此同时,CMECs中连接蛋白VE-Cadherin、PECAM-1表达显著降低;血管成管实验发现在AGEs诱导下CMECs的成管能力明显下降,以上结果提示,AGEs可诱导CMECs损伤。而在干扰CMECs中Peli1表达后,则可明显改善AGEs诱导的内皮细胞损伤。2.AGEs诱导CMECs 48小时后流式结果显示CMECs凋亡明显增加;caspase12/3酶活性检测试剂盒检测发现AGEs诱导CMECs后caspase1 2/3酶活性显著增加;western blot 结果发现在 AGEs 诱导下,CMECs 中 cleaved-caspase12/3 表达明显升高,以上结果提示,AGEs可以促进CMECs发生凋亡。但在干扰了 CMECs中Peli1后可以抑制caspase12/3酶活性、减少cleaved-caspase12/3表达。以上提示,干扰CMECs中Peli1表达可抑制AGEs诱导的内皮细胞凋亡。3.采用western blot法检测AGEs诱导CMECs中IRE1 α磷酸化水平,发现AGEs可促进CMECs中IRE1α发生磷酸化,促使其胞浆区招募大量的TRAF2,具体表现为IRE1α与TRAF2的结合增加;并进一步诱导其下游MAPK信号通路的活化,western blot结果显示p38及JNK的磷酸化水平显著增加。以上结果提示,AGEs诱导CMECs后显著增加IRE1α磷酸化及其下游信号分子的激活。但在干扰CMECs中Peli1表达后则可显著减少AGEs诱导的IRE1α磷酸化及其下游信号通路的活化。4.质谱法筛选出与Peli1结合的蛋白,即Hsp90;ZDOCK结果显示Hsp90与Peli1的Ring结构区相结合;分子动力学模拟发现Peli1 Ring结构区有多个Hsp90结合位点,前5个与Hsp90结合的关键氨基酸依次为ARG-279、ARG-222、ARG-326、LYS-229、LYS-374。以上结果提示Peli1的Ring结构区可能与Hsp90有结合。5.免疫共沉淀实验进一步验证这两个蛋白的结合情况,结果显示在CMECs中Peli1与Hsp90结合;外源性转入全长Peli1病毒（adv-Peli1）、突变Ring区的Peli1 病毒（adv-Peli1ΔRing）、突变 FHA 区的 Peli1 病毒（adv-Peli1ΔFHA）,免疫共沉淀实验发现在转染了突变Ring区的Peli1病毒后Peli1与Hsp90的结合几乎消失,提示Hsp90确实与Peli1的Ring区有结合。western blot法观察在单独或共转染Flag-Peli1和HA-Hsp90质粒后对IRE1α磷酸化的影响,发现单独转染Flag-Peli1质粒会显著促进IRE1α的磷酸化,但在同时转染Flag-Peli1和HA-Hsp90质粒后,IRE1α的磷酸化被抑制,提示Peli1介导的IRE1α磷酸化激活是依赖于Hsp90。结论综合在体及体外两部分实验结果,提示Peli1是糖尿病心肌微血管损伤发展进程中一个重要的调节蛋白,内皮细胞条件性敲除Peli1可以改善糖尿病心肌微血管损伤及心肌重塑与心功能减退,干扰Peli1表达亦可明显减轻AGEs所致的CMECs损伤。其机制可能与Peli1通过与Hsp90结合,影响内质网应激感受激酶IRE1α磷酸化,进而调控IRE1α及其下游信号密切相关。