奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及β-防御素4和5对其抑菌活性研究

来源 :河北农业大学 | 被引量 : 5次 | 上传用户:RyanDay
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奶牛乳房炎给奶牛养殖业造成巨大的经济损失,其致病因素包括化学、物理和微生物等,主要病原菌有金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠埃希菌等,目前尚未发现高效的防治方法。β-防御素(β-defensins)是一种阳离子抗菌肽,不仅免疫调节功能,而且可以通过破坏细菌细胞膜结构而具有抗菌功能,且不易产生抗药性。牛β-防御素4和5(mature bovine neutrophilβ-defensin 4 and 5,mBNBD4,mBNBD5)在体内参与炎症反应的成熟肽。为此,本研究从河北省患乳房炎奶牛的奶样品中分离了病原菌;并对已构建好的mBNBD4-pPIC9K和mBNBD5-pPIC9K毕赤酵母菌株,进行β-防御素的诱导表达和纯化;进一步利用纯化后的mBNBD4、mBNBD5体外作用于所分离的乳房炎病原菌,观察其体外抗菌效果。旨在为河北奶牛乳房炎致病菌进行流行病学调查并为mBNBD4、mBNBD5的应用提供理论依据。奶牛乳房炎致病菌的分离鉴定应用微生物学以及分子生物学方法,从河北地区采集159份患乳房炎的病牛乳样,进行细菌分离培养,并进行形态学、生化及PCR鉴定。结果分离出三类主要致病菌,金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、大肠埃希菌共96株。其中无乳链球菌56株,占总分离菌株数的58.3%,且有50株是β-溶血型,占无乳链球菌总数的89.3%,是致病性菌株,α-溶血型6株,占无乳链球菌总数的10.7%;其次是金黄色葡萄球菌共23株,占总分离菌株数的24.0%;大肠杆菌共17株,占总分离菌株数的17.7%。β-防御素的抑菌性检测对已构建好的mBNBD4-pPIC9K和mBNBD5-pPIC9K毕赤酵母菌株,进行重组蛋白的诱导、表达和纯化,并检测重组蛋白mBNBD4和mBNBD5的抗菌生物活性,本研究将上述分离到的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌分别与3种不同浓度的2种重组蛋白在琼脂板上共培养,重组蛋白的浓度分别为5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL,对菌落形成单位进行CFU平板计数法统计,结果发现20μg/mL的mBNBD4与20μg/mL的mBNBD5两种β-防御素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较强的抑菌活性,且抑菌活性在所试范围内与浓度呈正相关。而且从抑菌效果看,重组蛋白mBNBD4和mBNBD5对金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于大肠杆菌。本研究为防御素的对奶牛乳房炎的防治奠定了理论基础。
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