禽流感(Avian Influenza, AI)是由A型流感病毒引起的家禽一种疾病和感染,该病毒亚型众多,宿主范围广,易发生变异和重组。近年来,禽流感频繁爆发,不仅给养殖业造成了重大的经济损失,而且对人类的健康也构成了巨大的威胁。其中,危害较大的主要有H5、H7和H9亚型禽流感。为了及时诊断禽流感病毒感染,采取相应的防控措施,迫切需要建立一种快速检测禽流感病毒的方法。本研究采用一步法多重RT-PCR技术建立了禽流感病毒H5、H7和H9亚型快速诊断方法,制备了针对禽流感H5N1和H7N9亚型的单克隆抗体,并在此基础上,研制出检测H7N9亚型禽流感病毒的免疫胶体金试纸条。1 H5、H7和H9亚型禽流感病毒一步法多重RT-PCR方法的建立针对禽流感病毒M基因序列设计合成了1对AIV通用引物,针对H5、H7和H9亚型的HA基因分型设计合成了3对型鉴定引物。采用一步法多重RT-PCR技术建立禽流感病毒的快速分型诊断方法,并对其特异性和敏感性进行验证。结果表明,M基因和H5、H7、H9 AIV 的HA基因的扩增产物大小分别为30 0 bp, 173 bp, 525 bp和 378 bp,与预期的大小一致。对照组中的H1, H4, H6, H10, Hll, NDV, IBV扩增均为阴性；其灵敏度高,将病毒RNA稀释到10 ng/mL后,仍可扩增出特异性条带。应用所建立的一步法多重RT-PCR方法检测30份病料,鉴定结果与病毒分离后的血凝抑制试验的一致。2 H5N1和H7N9亚型禽流感病毒单克隆抗体的研制选择H5N1亚型和H7N9亚型禽流感病毒的代表株C18和JT。全病毒用蔗糖密度梯度纯化浓缩后免疫6-8周龄的Balb/c母鼠,通过传统ELISA方法结合血凝抑制法筛选阳性克隆,最终得到了10株能稳定分泌抗体的单抗杂交瘤细胞株,其中4株为针对H5亚型禽流感病毒的单抗,分别命名为1C4、5E10、1GI1、6F4:6株为针对H7亚型禽流感病毒的单抗,分别命名为3D8, 5D4, 3E4, 4F4, 6C5, 3G5。特异性结果显示,得到的10株腹水与H9、NDV和IBV都不反应。血凝抑制试验显示,5E10和1G11对C18有血凝抑制作用；4F4和6C5对JT有血凝抑制作用。Western-blot结果显示,1C4和6F4对C18有反应,均在55KD左右出现一条特异性条带。间接免疫荧光试验结果显示,1C4、5E10、1G11和6F4对C18产生特异性的荧光反应,同时1C4和6F4还与H5亚型禽流感病毒不同分支的病毒SY, LK, HA产生特异性的荧光反应,1C4和6F4反应较广谱。4F4和6C5对JT产生特异性的荧光反应。3检测禽流感H7N9亚型胶体金试纸条的研制通过柠檬酸三钠还原方法制备胶体金,试纸条采用双抗体夹心原理,将6C5单抗标记的胶体金-抗体复合物以1：10稀释度包被于金标垫上；将抗鸡多克隆抗体以1mg/mL的浓度包被于检测线,羊鼠IgG以1.5 mg/mL的浓度包被于NC膜的质控线。当检测样品中含有H7N9亚型病毒是两条线均显色,而不含有H7N9亚型病毒时就只有质控线显色。特异性实验表明,试纸条可检测H7N9亚型病毒,与其它亚型禽流感病毒及其它禽类病毒均没有交叉反应。广谱性检测表明,此试纸条可与所检测的H7N9亚型病毒均反应。用H7N9病毒尿囊液作为检测原时,敏感性可以达到检测2‘个血凝单位的病毒。