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梨是重要的温带落叶果树,冬季需经休眠度过外界极端低温的不利环境。梨树休眠的打破,需要一定时长的低温积累,若在此过程中低温积累时长不足,会对梨树来年的开花结果产生危害,使得梨树产量降低、品质变差,严重时还会危及树体寿命。已有研究发现,属于MADS-box转录因子家族SVP亚族的DAM基因在蔷薇科植物休眠过程中发挥关键调控作用。目前关于DAM基因的上下游基因及调控机制的研究虽取得了一定进展但仍存在许多未解之处。为明确DAM基因参与休眠过程调控的分子机制,本研究以‘砀山酥’梨花芽为研究材料,选定前人研究发现的PpyMADS71(PpyDAM1)为主要研究对象,对其上游调控因子展开挖掘与初步分析。具体工作及主要结果如下:1.梨PpyMADS71上游调控因子的探索利用酵母单杂交文库筛选的方法,寻找到3个可与PpyMADS71启动子互作的转录因子:PpyERF060、PpyGBF及PpyRAP2.4。通过这三个基因在‘砀山酥’梨休眠期间的表达模式、亚细胞定位、酵母转录激活活性试验及双荧光素酶试验,初步确定其定位于细胞核内、在‘砀山酥’梨休眠期间存在表达上调高峰且对PpyMADS71的启动子表达具有转录激活作用的PpyERF060可能是PpyMADS71上游发挥作用的转录因子。2.PpyERF060对PpyMADS71调控模式的研究利用酵母点突变试验及双荧光素酶试验,确定PpyERF060结合在PpyMADS71启动子的DRE1元件处;通过茄梨愈伤组织的转基因试验,进一步证明了PpyERF060对PpyMADS71的转录激活作用。同时对PpyERF060的上游基因展开探索,发现了可对其转录产生激活作用的PpyEIL1及PpyABF3,并初步确定PpyABF3在PpyERF060启动上的结合位点。此外,本试验还发现乙烯处理‘砀山酥’枝条上调PpyERF60的表达,且对PpyABF3的转录起到抑制作用;愈伤组织中过表达试验进一步证明PpyERF060对PpyABF3的转录起到抑制作用通过上述结果,我们初步发现PpyERF060、PpyABF3及PpyMADS71之间存在一个可将乙烯信号途径、ABA信号途径及休眠过程结合起来的调控网络。3.梨低温积累过程中DAM基因所受调控的研究采用人工低温积累模拟‘砀山酥’梨芽内休眠过程,确认‘砀山酥’梨打破内休眠需要1000小时以上的有效低温积累。在前人研究中发现的4个DAM基因中,PpyMADS28、PpyMADS29、PpyMADS71在低温积累过程中表达先增加随后逐渐降低,而PpyMADS31在整个低温积累过程中表达持续下降,表现出两种不同的表达模式;同时确认了PpyCYP707A3在整个低温积累过程中表达持续上升,可能通过降解ABA抑制PpyMADS71的转录,参与到休眠过程之中。此外,本试验寻找到了一个响应低温且可与PpyMADS71启动子互作并对其转录产生抑制作用的转录因子PpyMYB44,并初步探索了PpyMYB44在PpyMADS71启动子上的结合部位。