背景模式动物小鼠已建立超过32000个品系,美国、欧洲和日本先后建立冷冻胚胎和精子保存库代替传统连续繁殖方式,以保护小鼠这一重要遗传资源,预防小鼠资源流失。美国杰克逊实验室拥有世界上最丰富的小鼠资源和最大的冷冻胚胎、精子保存库,我国也先后成立国家啮齿类实验动物种子中心和国家遗传工程小鼠资源库,并建立了大型低温冷冻库。低温保存过程中,冷冻胚胎、精子遗传特征的稳定性是影响小鼠遗传质量的重要影响因素之一,同时现代生物医学研究已经离不开具有稳定遗传特性的实验小鼠。因此通过科研人员的努力,针对实验小鼠个体的遗传检测方法已在不断的建立、完善,但国内尚缺乏小鼠冷冻胚胎和精子的遗传鉴定方案。主要是因为样本有限且十分珍贵,相应的DNA量又远低于常规个体。因此,研发针对特定区段、极微量的DNA前处理和DNA扩增方案,是建立冷冻胚胎和精子的遗传鉴定检测的首要任务。同时经过初步扩增的DNA样本,可以进一步经DNA分子标记检测,准确判断其遗传背景和品系。方法本研究以中科院上海实验动物中心(国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心)提供的小鼠冷冻胚胎和精子为实验样本。小鼠胚胎的DNA采用直接裂解法,后利用全基因组扩增试剂盒获得检测所需要的大量DNA;精子DNA采用动物基因组dna快速抽提试剂盒(上海生工生物工程有限公司)进行抽提。抽提的dna采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测抽提dna的量。抽提的dna经四组多重pcr扩增,以pcr产物为模版进行多重高温连接酶的连接检测反应(ligasedetectionreaction,ldr),ldr产物采用标准6%变性测序page胶进行电泳分析。最后使用genetm672来收集数据并用genemapper进行基因分型。该pcr-ldr检测技术选取了小鼠21条染色体上的45个snp位点,分成4组,每组分别为12、11、10、12个snp位点。针对这些位点分别设计引物和探针,实现snp基因分型。结果改进的小鼠冷冻胚胎、精子dna提取方案,采用显微挑取法获取正常2细胞期胚胎,并以200mmol/lkoh、50mmol/l二硫苏糖醇的裂解液(ph8.3)来获取胚胎微量dna;精子dna通过添加dtt和蛋白酶k消化6h的抽提试剂盒抽提获得。此方案能够高效地获取胚胎和精子dna。通过全基因组扩增试剂盒实现小鼠胚胎微量dna扩增方案,从扩增和检测结果看出,胚胎2细胞期细胞量≥12个最佳。pcr-ldr分型方案适用于小鼠45个snps的分型。该方案以fvb小鼠为验证样本,分型的45个snps位点基因型与ncbi数据库中的信息完全一致;并且以rs13477094位点为例,经测序验证后,分型结果与其一致。通过以上这些方案结果,本研究成功地将小鼠冷冻胚胎和精子snps分型方案应用于12种品系小鼠冷冻胚胎和精子的遗传背景鉴定。结果显示45个SNP位点全部检测出的概率高达95%以上。其中小鼠胚胎NOD、DBA1品系有1个SNP点未检出,EG、Scid品系有2个点未检出,BALB/c、ACA品系有4个点与NCBI数据库中信息不符;12个品系间两两进行位点差异比较,最大差异点个数为30个,最小差异点个数为8个,平均差异位点个数为19个。小鼠精子中NOD、B10A品系有1个SNP点未检出,NOD-Scid、Scid-BG品系有2个点未检出,C3H-Scid,C3H/ORL品系有3个点与NCBI数据库中信息不符;12个品系间两两进行位点差异比较,最大差异点个数为29个,最小差异点个数为7个,平均差异位点个数为18个。由此可见45个SNP位点在检测小鼠冷冻胚胎和精子品系中的鉴定效果较高,可以避免只通过几个SNP区分品系的情况;并且将45个SNPs位点组成DNA序列,通过进化树分析12个品系的胚胎和精子,验证了ICR、KM小鼠为封闭群小鼠,其余品系为近交系小鼠。结论本研究以中科院上海实验动物中心提供的小鼠冷冻胚胎和精子为样本,采用直接裂解法、全基因组扩增技术和PCR-LDR技术,实现小鼠冷冻胚胎和精子45个SNPs的基因分型和遗传质量鉴定。