论文部分内容阅读
紫细菌作为不产氧光合细菌的一大类群,是研究光合作用机理的模式生物,在光适应过程中进化出了多种响应机制,例如调控外周捕光复合体（LH2）的数量和形成异常光谱的LH2,如LH3（B800-820）和LH4（B800-low-850）。目前对于异常光谱LH2形成机制的认识主要是由于LH2的αβ多肽中关键氨基酸发生突变,以及在基因组中存在编码αβ肽的多拷贝pucBA基因。关于异常光谱LH2是否有利于菌体适应低光的生长,目前还不甚清楚,仅报道少数菌株中的LH3比LH2能量传递效率高,而有关LH4的研究鲜有报道,尤其缺乏其低光促生长的实验证据。因此,针对异常光谱LH2是否有利于菌体适应低光生长以及多拷贝pucBA基因在细菌生长过程中贡献尚不明确的问题,本研究采用基因敲除的方法,以沼泽红假单胞菌（Rhodopseudononas palustris）CGA009为材料,依次敲除了编码LH2多肽的5对pucBA基因,共获5个缺失突变株,对其进行了生物学特性研究;并将LH4（pucBAd）基因回补至pucBA基因全部缺失的突变株中。本研究揭示出LH4在低光强下更有利于菌株生长,提出了一种新的LH4低光促生长作用机制,在完善不产氧光合细菌pucBA基因操作遗传体系的基础上,为深入理解异常光谱LH2的低光适应机制提供了理论参考依据,并为进一步研究多拷贝pucBA基因在LH2蛋白亚基的相互作用、组装和功能中的贡献提供了良好的研究材料。主要研究结果如下:首先,敲除CGA009菌株中编码LH4αβ肽的基因,获得突变株ΔpucBAd。在高光强下,突变株与野生株的生长速率、活细胞和光合膜的吸收光谱、光合色素（BChl a和Car）的含量与组成并无明显差异;在低光强下,突变株的生长速率降低,在活细胞和光合膜的吸收光谱中均检测不到LH4的特征吸收峰,光合色素的含量和组成与野生株无明显差别。由此表明,LH4的缺失不影响菌株在高光强下的生长,但不利于其在低光强下的生长。根据LH2和LH4的荧光峰特征,本文提出了一种新的能量传递活性的计算方法,合理地解释了LH4低光促生长的机制:LH2在850 nm有强吸光特性,而LH4在850 nm吸收光谱却很低,使得LH4对光激发产生的850 nm荧光有很少的自吸收,因此能够提供数量更多、能量更高的光子,从而具有更高的能量传递活性。其次,在突变株ΔpucBAd的基础上逐一敲除其余4个pucBA基因,获得4个突变株ΔpucBAda、ΔpucBAdab、ΔpucBAdabe和ΔpucBA。与CGA009菌株在高低光强下合成LH2和LH4的吸收光谱特征相比,ΔpucBA在高低光强下的Qy带分别为804和871 nm、804和875nm,表明该菌株不再合成LH2,仅含RC-LH1。与CGA009相比,ΔpucBA在高低光强下的生长速率减慢,光合色素含量降低,表明LH2的缺失使菌株的捕光能力降低。最后,本研究初步建立pucBA基因恢复表达的遗传体系,将编码LH4多肽的pucBAd分别克隆至pBBR1MCS-2和pVLT33表达载体,转入ΔpucBA,通过检测其吸收光谱,比较了两种遗传工具对pucBA基因回补的影响,并未观察到明显的LH4高表达特征吸收光谱。综上所述,本研究为LH4的低光促生长提供了实验证据,LH4在低光强下的合成有利于菌株的生长;提出了一种新的LH4低光促生长的机制。通过基因敲除获得了5拷贝pucBA全部缺失的CGA009菌株,为多拷贝pucBA基因编码的αβ肽相互作用的研究提供理想菌株;初步建立了pucBAd基因的回补,完善不产氧光合细菌的遗传体系,仍需进一步探索用于多拷贝pucBA基因编码的αβ肽相互作用和LH2正确组装的遗传工具。