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烟草花叶病毒(TMV)是一种寄主众多、传染性强和抗逆性强的植物病毒,至今尚未有一种方法能对TMV进行根除。绿色环保的生物农药是抑制病毒的方法之一。Flammutoxin(FTX)与其仅相差20个氨基酸的前体物质TEER-decreasing protein(TDP)是仅仅产生于金针菇子实体发育与生长阶段的蛋白质。研究发现,FTX或TDP具有抗TMV特性,但目前还没确认在抗TMV过程中到底是哪种蛋白发挥作用或主要作用。为了确认不同蛋白的抗TMV效果及分析可能的抗病机制,本实验利用大肠杆菌表达体系,成功构建了 FTX和TDP的原核表达重组质粒,随后通过诱导表达获得TDP-pET32a和FTX-pET32a重组蛋白并利用固定化金属离子亲和层析(IMAC)进行纯化。结果显示,采用1mM浓度的诱导剂IPTG,于37℃诱导8h蛋白可以得到较多的蛋白,且pET32a标签蛋白、重组蛋白 FTX-pET32a 和 TDP-pET32a 在 250mM、200mM 和 250mM Elution buffer洗脱下能获得更多的纯化蛋白。以K326普通烟草为研究对象,从蛋白的保护作用和治疗作用两个方面研究了 FTX和TDP蛋白的抗病毒机制。蛋白的保护作用是先在烟草K326上分别喷洒FTX和TDP蛋白,12h后接种病毒TMV,随后测定了烟草在1-9天内的过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、几丁质酶以及多酚氧化酶(PPO)等与防御有关的防御酶的酶活性。结果发现经过蛋白FTX和TDP处理的烟草在接种TMV后,在1-9天内,其酶活性相对于三组对照组均有不同程度的提高(比如在第7天,POD的酶活性测定中,TDP为26.8U/g,FTX为24.4U/g,相比于三组对照组的数值(18.6U/g,21.3U/g和19.5U/g)酶活性更高。实验结果说明TDP和FTX可诱导普通烟草的抗TMV活性且TDP的诱导抗性效果高于FTX。治疗作用则是先在K326烟草接种TMV,12h后分别喷洒FTX和TDP蛋白,使用实时荧光定量PCR检测烟草在喷洒蛋白FTX和TDP后的1-9天内TMV含量变化,以高度保守的β-actin基因为内参,结果发现,在1-9天内,相对于两组对照组,蛋白TDP处理组和FTX处理组体内TMV的含量明显比对照低,而蛋白TDP处理的烟草比FTX要高,说明两种蛋白均能抑制病毒在烟草体内增殖,两者在第7天的抑制率甚至达到了 70%,并且TDP比FTX具有更强的抑制效果。本研究获得了 FTX及TDP的原核表达产物,确定了两种原核表达产物与其直接提取物一样具有较强抗病毒效果,可进一步开发成低成本的生物农药。我们推测最初从金针菇中纯化的蛋白可能就是FTX及TDP的混合物。研究结果还表明TDP相对FTX具有更强的抗病毒效果,而不管是FTX还是TDP,它们既能诱导普通烟草产生抗性来抑制TMV的侵染,又能直接抑制TMV在寄主体内的增殖,其抗TMV机理可能是多方面的。