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甘露低聚糖作为功能性低聚糖除了具有促进双歧杆菌的生长繁殖以外,近几年的研究表明:它是唯一一种能与肠道中外源病菌结合的功能性低聚糖。它将有望成为抗生素的“替代品”。本论文通过对β-甘露聚糖酶的制备,酶的性质,β-甘露聚糖酶的固定化,固定化酶性质以及固定化酶制备葡甘露低聚糖的工艺进行研究。
用硫酸铵盐析法纯化β-甘露聚糖酶,结果表明去除杂蛋白的最佳硫酸铵饱和度为40%,酶比活力上升了22.5%。β-甘露聚糖酶的最适反应pH值和最适反应温度分别为4.2和60℃;该酶在pH4.0~5.4范围内具有良好的稳定性;在小于60℃下酶具有良好的热稳定性;在最适反应温度60℃下保温4h之后,剩余酶活力为85%。
选用0.6%乙二醛溶液常温下,pH4.2~5.8,料液比为1∶25交联壳聚糖-硅胶制备载体。0.3g载体最适加酶量为2352U,吸附时间8h以上,固定化酶活力回收率为52.1%。
固定化β-甘露聚糖酶的最适反应温度和最适反应pH值分别为75℃和5.8;该酶在小于70℃范围内有较好的热稳定性;pH稳定范围:4.2~5.8;储存方式:将制备好的固定化酶浸泡在缓冲溶液中4℃保藏;载体与酶蛋白结合的牢固程度:固定化酶在震荡水槽中(100次/min)常温下震荡24h后,剩余酶活力为64.5%;贮存性能:固定化酶在4℃下保存10天后,剩余酶活力为79.4%。
用薄层色谱洗脱法检测葡甘露低聚糖的含量,结果表明采用上行薄层色谱法,以硅胶G为载体,正丙醇与水85∶15为展开剂,点样量为50uL,按照低聚糖的Rf值将硅胶板上相应的硅胶刮下,用纯净水洗脱定容至25mL。取洗脱液2mL用苯酚-硫酸法检测计算葡甘露低聚糖的含量。
由单因素实验得出固定化甘露聚糖酶制备葡甘露低聚糖的最适反应时间为15h;最适魔芋胶浓度为2.0%;最适加酶量为13300U。由均匀实验得出:四个因素对指标影响的主次顺序为:χ4(魔芋胶浓度)>χ2(加酶量)>χ1(反应时间)>χ3(反应温度)。通过单因素和均匀实验确定出合成葡甘露低聚糖的最佳工艺条件为:魔芋胶浓度为1.5%、加酶量为13300U、反应温度65℃、反应时间15h、pH值为5.8、震荡水槽频率为100次/min,葡甘露低聚糖得率为:30.8%。