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背景与目的：恶性肿瘤是一类全身性、致命性疾病，早期确诊和治疗非常重要。虽然目前常用的医学影像设备（如CT、MRI、PET/CT、B超）为肿瘤的诊断提供了可靠、无创的手段，应用增强扫描对鉴别肿瘤的良恶性提供了较大价值。但这些诊断技术对早期或者较小病变（如肺部小结节）的良恶性判断仍然存在一定难度，有些病变（如软组织肿瘤）即使已较大，其良恶性判断也很难，此外，有些良性病变的血供也很丰富，依靠增强扫描也难与恶性肿瘤鉴别。目前，恶性肿瘤的确诊主要依靠病理学检测，它主要从细胞、分子及基因等水平对疾病进行诊断，比依靠病变解剖形态、血供、代谢的异常改变进行诊断更为确切，是诊断恶性肿瘤的“金标准”；其中，肿瘤标记物的检测已被广泛用于恶性肿瘤的诊断、指导治疗方法的选择以及预后的判断中。研究表明，在>85%的恶性肿瘤内可检测到端粒酶活性，而在正常（除少数正常需要更新）的组织和良性病变中端粒酶为失活状态，这表明端粒酶可作为恶性肿瘤的特异性标记物。由于端粒酶的活性表达是肿瘤细胞获得无限增殖能力的基础，与恶性肿瘤的发生、发展及预后均有密切联系。更为重要的是，与其他肿瘤标志物如癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）、前列腺癌特异性抗原（PSA）等只针对某特定来源肿瘤的标志物相比，端粒酶活性与肿瘤的组织来源无关，可用于广谱恶性肿瘤的诊断。但目前端粒酶活性的检测主要依靠病理学方法，这需要先获取病灶标本，而有些病变位置较深或邻近心脏大血管等特殊部位，不易进行取材。因此有必要建立一种无创性检测组织细胞端粒酶活性的方法，从而达到活体特异性诊断恶性肿瘤的目的。国内外许多研究充分证实：细胞内铁蛋白浓度增加，可使细胞摄取更多的铁离子，导致周围质子的横向弛豫率显著升高，其MR信号发生变化，表明铁蛋白可作为报告基因用于MR成像。如果能使铁蛋白基因靶向性高表达于端粒酶阳性细胞内即可实现应用MR成像无创性检测端粒酶活性的目的。大量研究表明人端粒酶逆转录酶（hTERT）的启动子可调控基因靶向性表达于端粒酶阳性细胞内，是目前已知最广谱的恶性肿瘤特异性启动子。因此，我们设想将铁蛋白置于hTERT启动子的调控之下，则该报告基因可靶向性高表达于恶性肿瘤细胞内，导致此类细胞的MR信号发生改变。通过此方法有望实现应用MR成像技术无创性检测肿瘤端粒酶活性，从而可实现活体早期特异性诊断恶性肿瘤的目的。综上分析，本研究通过构建由hTERT启动子调控MR铁蛋白重链（Fth）报告基因表达的慢病毒载体，将其感染体外细胞。探索hTERT启动子调控的MR报告基因成像技术检测体外肿瘤细胞端粒酶活性的可行性，为进一步应用该成像技术活体诊断恶性肿瘤提供实验基础及理论依据。方法：1）制备慢病毒载体Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro和Lenti-CMV-Fth1-3flag-Puro人工合成铁蛋白重链（Fth1）基因并连接上3flag序列，然后克隆入pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体的多克隆位点内，获得pCDH-CMV-Fth1-3flag-Puro对照载体；应用PCR法扩增得到hTERT启动子基因片段，然后替换CMV启动子获得pCDH-hTERT-Fth1-3flag-Puro目的载体。将上述2种表达载体分别同pCD/NL-BH*DDD包装质粒、pLTR-G膜蛋白表达质粒共感染293T包装细胞，收集慢病毒上清，采用定量PCR法测定病毒滴度。将所得慢病毒载体分别命名为Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro和Lenti-CMV-Fth1-3flag-Puro。2）MR成像检测肿瘤细胞端粒酶活性的体外研究分别应用慢病毒Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro和Lenti-CMV-Fth1-3flag-Puro载体感染端粒酶阳性细胞（A549、SKOV3和293T）以及端粒酶阴性细胞（U2OS和HPDLF）。其中，感染慢病毒Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro载体的3株端粒酶阳性细胞为实验组，感染慢病毒Lenti-CMV-Fth1-3flag-Puro载体的5株细胞为阳性对照组，感染慢病毒Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro载体的2株端粒酶阴性细胞和未感染慢病毒载体的5株细胞为阴性对照组。采用免疫荧光染色检测各细胞内flag表达情况，采用EILSA检测各细胞Fth表达水平。应用CCK-8试剂检测感染慢病毒载体以及添加FAC培养细胞对细胞增殖活性的影响，应用普鲁士蓝铁染色和总铁检测试剂盒检测细胞聚铁效能，采用MR扫描检测细胞T2*WI信号变化。结果：1）经酶切及测序证实铁蛋白重链（Fth1）报告基因合成成功并准确插入载体内，hTERT启动子基因扩增成功并正确重组入表达载体内，成功构建目的载体和对照载体；将所得表达载体进行慢病毒包装，所得两种病毒滴度约为5x108TU/ml，可满足实验所需。2）细胞感染慢病毒载体后，应用免疫荧光染色检测各细胞（包括感染和未感染者）内flag蛋白表达情况，结果显示：感染慢病毒Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro载体后，只有端粒酶阳性（A549、SKOV3和293T）细胞内检测到有flag蛋白的表达，端粒酶阴性（U2OS和HPDLF）细胞内未能检测到有flag蛋白的表达；而感染对照慢病毒Lenti-CMV-Fth1-3flag-Puro载体的5种细胞均检测到有flag蛋白的表达，未感染细胞内均未检测到flag蛋白的表达。采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测各细胞内Fth蛋白表达水平，结果显示:感染慢病毒载体Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro的3株端粒酶阳性细胞（A549、SKOV3和293T）和感染慢病毒载体Lenti-CMV-Fth1-3flag-Puro的5株细胞Fth蛋白水平均较相应未感染细胞显著升高（p<0.05），而感染慢病毒Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro载体的2株端粒酶阴性细胞（U2OS和HPDLF）的Fth蛋白水平较相应未感染细胞无显著变化（p>0.05）。3）用CCK-8试剂检测细胞增殖活性，结果示：同种细胞感染或未感染慢病毒载体组（WT组、CMV组和hTERT组）细胞之间增殖活性无显著差异（p>0.05），说明铁蛋白的高表达不影响细胞增殖活性；同种细胞用补充或不补充FAC（1mM）培养基培养48小时后，两组（+FAC组和-FAC组）细胞之间增殖活性亦无明显差异（p>0.05），说明补充FAC培养细胞亦不会影响细胞的增殖活性。细胞用添加FAC（终浓度1mM）的培养基培养48小时后进行普鲁士蓝铁染色，结果示：感染慢病毒载体Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro的3株端粒酶阳性细胞和感染对照慢病毒载体Lenti-CMV-Fth1-3flag-Puro的5株细胞内均可见大量明显蓝染颗粒，而感染慢病毒载体Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro的2株端粒酶阴性细胞和未感染慢病毒载体的5株细胞内仅见极少量浅淡的蓝染颗粒。用同样方法培养细胞后进行细胞总铁含量检测，结果示：感染慢病毒载体Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro的端粒酶阳性细胞和感染对照慢病毒载体Lenti-CMV-Fth1-3flag-Puro的5株细胞铁含量均较相应未感染细胞显著增加（p<0.05），而感染慢病毒载体Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro的端粒酶阴性细胞铁含量较未感染细胞无显著变化（p>0.05），细胞含铁量检测结果与普鲁士蓝铁染色一致，说明高表达铁蛋白重链的细胞摄铁能力明显增强。4）将细胞用补充有FAC（终浓度1mM）的培养基培养48小时后进行MR扫描，结果显示：当感染慢病毒载体Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro后，3株端粒酶阳性细胞的T2*WI信号显著下降，R2*值较相应未感染细胞明显升高（p<0.05），而2株阴性细胞的T2*WI信号无明显降低，R2*值较未感染细胞无显著变化（p>0.05）；而感染对照慢病毒Lenti-CMV-Fth1-3flag-Puro载体后，5株细胞T2*WI信号均有明显降低，R2*值均较未感染细胞明显升高（p<0.05）。说明感染慢病毒载体Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro后，只有端粒酶阳性细胞的MR信号发生改变。结论：本实验中所构建的慢病毒Lenti-hTERT-Fth1-3flag-Puro载体具有严格的端粒酶靶向特性。当细胞该慢病毒载体感染后，只有端粒酶阳性的细胞会高表达铁蛋白重链，导致细胞摄铁量显著增加，增加的铁能显著降低细胞的T2*WI信号，即只有端粒酶阳性细胞的MR信号会发生改变。说明应用hTERT启动子调控的MR报告基因成像技术可无创性检测肿瘤细胞端粒酶活性。该实验的成功实施为进一步应用该成像方法非侵入性在体诊断广谱恶性肿瘤提供了实验基础及理论依据。