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目的构建人色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor, PEDF)重组慢病毒并体外感染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSCs),研究PEDF的体外表达情况和生物学活性。方法将人全长PEDF cDNA亚克隆至慢病毒表达质粒pLV-GFP,并通过酶切和测序鉴定。磷酸钙共沉淀法将慢病毒表达质粒和两个包装质粒共转染293T细胞,收集病毒上清。用超滤法纯化病毒,并通过用荧光激活细胞分选术(Fluorescence-activated cell sorter,FACS)进行病毒滴度测定。从人骨髓中分离、培养MSCs并体外感染重组慢病毒。荧光显微镜下观察感染细胞的GFP表达情况,并通过流式细胞仪检测人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells, hMSCs)的感染效率。分别通过RT-PCR、Western blot、酶联免疫吸附测定法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测感染细胞PEDF的表达水平,并通过人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)小管形成实验检测重组PEDF的生物学活性。结果慢病毒表达质粒pLV-PEDF-GFP经限制性内切酶酶切电泳后显示1.3kb的PEDF目的基因片段,测序结果表明目的片段与Gene bank中PEDF cDNA序列完全一致,且插入方向正确;经293T包装后产生LV-PEDF-GFP重组慢病毒,其滴度为5×107-1×108 TU/mL,纯化后滴度可达2×1010 TU/mL。病毒感染hMSCs后,荧光显微镜下观察,几乎所有细胞都表GFP,流式细胞仪检测hMSCs的感染效率可达96.38%。RT-PCR结果显示,hMSCs-PEDF在mRNA水平上有PEDF高表达。Western blot和ELISA结果表明,hMSCs-PEDF能够高效表达PEDF蛋白,且重组PEDF可抑制HUVECs的小管形成。结论本实验成功构建PEDF重组慢病毒载体,重组慢病毒感染hMSCs后,能够高效表达具有生物学活性的PEDF。骨髓间充质的分离、培养及基因修饰的成功,为其进一步的体内、外研究奠定了物质基础。目的研究肿瘤细胞条件培养基能否刺激hMSCs的迁移;建立肝癌裸鼠原位模型,观察hMSCs经尾静脉注射后能否向肿瘤组织趋向转移。方法(1)收集肿瘤细胞条件培养基,利用Transwell小室进行hMSCs的体外迁移实验。(2)利用转LV-GFP的MHCC-97H细胞建立转移性肝癌裸鼠原位模型,hMSCs经CM-DiI标记后通过尾静脉输入荷瘤裸鼠体内,分别在hMSCs注射后7天和14天,处死裸鼠,取肝脏、肺、脾、心、脑、胰、肾组织,冰冻切片于荧光显微镜下观察hMSCs在体内的分布。结果与对照组相比,hMSCs、hMSCs-PEDF向肝癌细胞条件培养基迁移的细胞数明显增加(*p < 0.001),说明肝癌细胞分泌的某些因子能够刺激hMSCs的趋向性转移,且慢病毒的转染不影响hMSCs的迁移能力。尾静脉注射后7天,hMSCs主要分布于肿瘤与正常肝组织的交界处,但仍有少数hMSCs滞留于肺组织;注射后14天,hMSCs广泛分布于肿瘤组织,此时,在肺部已检测不到hMSCs;而hMSCs注射后7天及14天,均未在其它组织(脾、心、脑、胰、肾)观察到其存在。结论本研究证实了BM-MSCs具有向肝癌迁移的能力,为下一步利用hMSCs作为载体进行肝癌治疗的研究提供了有力的依据。目的观察hMSCs-PEDF经尾静脉注射后对肝癌生长和肺转移的影响。方法在肝脏原位接种肿瘤10天后,将裸鼠随机分为4组(每组22只),通过尾静脉分别注射PBS、hMSCs-GFP、hMSCs-PEDF和重组慢病毒LV-PEDF。治疗后35天,处死裸鼠(每组12只);取肝脏组织,测量肿瘤体积;观察不同治疗方法对肝癌生长和肺转移的影响。余下每组10只用于生存期观察。抗CD34抗体免疫组化染色分析肝脏肿瘤中的血管密度,并通过ELISA检测血清中的PEDF浓度。结果hMSCs-PEDF治疗能够显著抑制肝癌的生长和自发性肺转移,并明显延长荷瘤裸鼠的生存期,且hMSCs-PEDF治疗组血清中PEDF水平明显低于LV-PEDF治疗组。免疫组化结果显示,hMSCs-PEDF治疗能够显著降低肝脏肿瘤中的血管密度。结论本研究首次报道了利用hMSCs作为载体进行肝癌治疗的实验研究,并取得了显著的治疗效果,为肝癌的治疗提供了一条新的思路。