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牙周炎是以牙龈红肿、出血、溢脓、龈肉萎缩、牙龈外漏、牙齿松动为特征的多因素疾病,主要病理变化经过牙龈炎症和出血、牙周袋形成、牙槽骨的丢失、牙齿的松动和移位导致牙齿丧失。牙周炎是人类口腔中常见疾病之一,根据第三次全国口腔健康流行病调查,当前我国成年人中80-97%患有不同程度的牙周疾病,其中慢性牙周炎是牙周炎的一种。美国进行流行病学研究估计,超过四百万45岁以上的美国人患有牙周炎疾病。本研究第一部分以中度慢性牙周炎患者龈下菌斑为材料,采用宏基因组学方法筛选胰蛋白酶样酶基因。首先提取中度慢性牙周炎患者龈下菌斑总DNA,利用pWEB-TNCTM Fosmid Cloning Kit,构建了一个含有6500个克隆子的中度慢性牙周炎患者龈下菌斑宏基因组文库。平均每个克隆子插入基因片段的大小为30Kbp。整个宏基因组文库外源DNA容量为200M bp。随机挑选的12个克隆子经BamH I酶切鉴定,克隆子的插入片段具有随机多样性。用BANA方法从宏基因组文库中筛选得到了一个可以表达胰蛋白酶样酶的克隆子E5,对这个克隆子进行16S rDNA分子鉴定,克隆子E5的16S rDNA与假单胞菌属(Pseudomonas)的16S rDNA的核酸序列具有97.5%的相似性。提取克隆子E5的质粒,构建亚克隆文库,通过进一步的筛选,将产胰蛋白酶样酶的基因片段缩小至2671bp左右,将该基因片段进行全序列测序,分析表明该核酸序列包含了一个由1071个核苷酸组成的开放阅读框,该开放阅读框编码的氨基酸序列与胰蛋白酶样酶的丝氨酸蛋白酶(trypsin-like serine protease)氨基酸序列有75%的相似性。本论文第二部分运用细菌的核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析(ARDRA)、单链构象多态性(SSCP)技术对慢性牙周炎患者菌斑的群落结构进行多样性分析,采用ARDRA分析中度慢性牙周炎菌斑的细菌菌群,建立了龈下菌斑、唾液和龈沟液16S rDNA文库。其中龈下菌斑16S rDNA文库中的92个克隆子得到61种OUTs,唾液16S rDNA文库中的96个克隆子得到34种OUTs,龈沟液16S rDNA文库中的94个克隆子得到42种OUTs,在文库标准多样性指数方面,龈下菌斑样品的香侬-威纳指数(Shannon-Wiener index (H))、辛普森指数(Simpson index (D))和丰富度指数(Margalef’s richness index (R))分别为3.92、0.938、38.23,均大于龈沟液样品的3.37、0.867、17.29和唾液样品的3.21、0.863、12.26,龈下菌斑样本具有更高的物种多样性。采用PCR-SSCP技术研究健康者和中度、重度慢性牙周炎患者的龈下菌斑菌群结构,通过提取不同炎症程度病人的龈下菌斑提取总DNA,分别扩增其16S rDNA的V4-V5区域,将其扩增产物进行酶切、变性,得到的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。慢性牙周炎的几种主要致病菌如中间普氏菌(Prevotella intermedia)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、直肠弯曲菌(Campylobacter rectus)、小韦荣球菌(Veillonella parvula)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)在本实验中均有较高的检出率,且随着慢性牙周炎的发生和发展,其检出率也变高。