纸质微流控芯片是近几年来发展的一种新型的微流控芯片。它以纸质作为基底替代硅、有机玻璃、高聚合物等材料,再通过各种加工处理技术,在纸质载体上加工出有一定结构的亲/疏水通道及相关分析检测器件,构建“纸上微型实验室”(lab-on-paper),也称为纸质微流控分析器件(microfluidic paper-based analytical devices,μPAD)。本研究论文以用于医疗诊断领域的免疫分析纸芯片为研究对象,以提高纸芯片上的测定灵敏度为目的,针对传统纸上洗涤模式无法有效降低免疫分析中的背景信号的问题,结合课题组的前期工作,提出了一种新型纸上立体洗涤模式,从而可以有效降低免疫纸芯片上的背景信号,提高测定的灵敏度;同时将信号放大模式应用在纸芯片之上,将纳米金和碳纳米粒子作为信号放大载体,建立了两种测定癌症标志物的灵敏检测方法。本论文分为两部分,第一部分为综述,主要介绍了纸芯片概述、发展及免疫分析技术在纸芯片上的应用。第二部分为研究报告,由三部分构成,具体内容如下:一.环炉-三维洗涤技术在免疫纸分析芯片上的研究本研究工作主要将环炉-三维洗涤模式应用到纸芯片免疫分析中,实现了纸上非特异性结合抗体的有效洗涤并降低背景信号,灵敏检测了血清中癌胚抗原(CEA)的含量。本研究工作设计了可翻折的三维芯片,并将废液区贴在环炉加热带内侧,加热的废液区域使非特异性结合的抗原抗体在重力作用和纤维毛细作用力的双重作用下,可更容易的从检测区洗涤至废液区。另外环炉加热带的加热作用促进了液体的流动,更利于洗涤的进行。通过利用这种新的三维洗涤模式,实验中得到了更低的背景信号,而且,整个实验的洗涤时间被缩短,提高了检测的灵敏度和检测效率,实验结果显示,比色法中的颜色强度与抗原的浓度有很好的线性关系,检出限为0.02ng/mL。与传统洗涤方法相比,该方法的洗涤效果更好,有效的降低了非特异性吸附产生的背景信号,为纸芯片免疫洗涤提供了一种自动化、简单快速的新方法。二.基于糖延迟技术及纳米金信号放大的化学发光免疫纸芯片研究本研究工作将糖延迟技术应用于纸芯片化学发光免疫分析中,并结合纳米金的信号放大技术,实现了癌胚抗原(CEA)、糖类抗原125(CA125)、糖类抗原199(CA199)三种癌症标志物的检测。把装有蔗糖溶液的笔头安装在切绘机上,将蔗糖精准的刻画在纸芯片通道上,通过控制试剂在通道上的迁移速率,可在相同长度的通道上实现不同程度的时间延迟,从而在检测区依次得到最大化学发光信号,该糖延迟技术简单、快速、自动化程度高。另外,结合信号放大技术,将Ab2-HRP标记在纳米金(AuNPs)上,HRP催化Luminol-H202化学发光体系实现信号放大,与传统的Ab2-HRP作为信号探针的免疫方法相比,AuNPs-Ab2-HRP所测得的化学发光信号放大了 6.6倍,化学发光信号强度与抗体的浓度呈较好的线性关系,在最佳的实验条件下,测得CEA、CA125、CA199的检出限依次是0.03ng/mL,0.2U/mL,0.2U/mL。该方法为多组分检测提供了一种灵敏度高且快速简单的免疫检测新方法。三.基于碳纳米粒子信号放大的化学发光免疫纸芯片研究本研究工作将碳纳米粒子的信号放大方法与免疫纸芯片相结合,通过化学发光检测实现了血清中癌胚抗原(CEA)的灵敏检测。以碳纳米粒子为载体,将HRP和antiCEA-HRP按一定比例结合到纳米粒子表面,经双抗体夹心免疫后,通过HRP对鲁米诺化学发光体系的催化作用而产生增强了的化学发光信号,实现信号放大,从而可灵敏检测CEA。结果表明,其发光强度与CEA浓度呈较好的线性关系,与传统的Ab2-HRP免疫检测方法相比较,检测信号强度放大了 9.5倍,且检出限低至3 pg/mL。这种方法检出限较低而且操作简单,为生物大分子蛋白分析提供了新方法。