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H9N2亚型低致病性禽流感病毒(LPAIV)在世界各地广泛流行,与其他细菌的共感染尤其是与大肠杆菌的混合感染导致养禽业蒙受严重的经济损失。虽然H9N2病毒感染已被证明可促进细菌感染,但其机制尚不清楚。通过实验室前期研究,初步筛选了一些可能与细菌粘附相关的蛋白如TGF-β1、整合蛋白、皮层蛋白、钙粘蛋白、黏着斑蛋白、纤调蛋白等。其中TGF-β1作为一种免疫调节因子和促炎因子能够介导某些细菌粘附。目前关于TGF-β1的大部分研究主要集中在人源,而关于鸡TGF-β1(与人源的氨基酸序列同源性仅约60%)与禽病原菌感染之间相关性的研究尚未有报道。鸡TGF-β1蛋白可能在H9N2病毒诱导的继发性大肠杆菌感染中发挥重要的作用,但是其中更为详细的机制还仍不清楚。因此,本研究以病毒、细菌和宿主之间的关系为基础,揭示参与H9N2 AIV引起的继发性细菌感染的宿主因素,提供一种解释流感病毒和细菌之间的协同致病机制的新的理论依据,有望为抗感染药物的研究提供潜在的分子靶点。本研究分为以下三个部分:1.H9N2 AIV对大肠杆菌粘附宿主的能力及特性分析将鸡胚成纤维细胞(DF-1)在6孔细胞板上培养,长至单层后随机选3个细胞孔接种H9N2病毒,其余3个细胞孔作为对照不接种病毒。24 h后,在该细胞板的6个细胞孔中接种禽致病性大肠杆菌(APEC),置于4℃冰箱孵育2 h之后,用细胞刮刮起细胞,利用涂布法检测APEC数量。在体内试验中,用无菌隔离器喂养30只1周龄SPF鸡,15只经鼻腔接种H9N2病毒,另外15只鸡鼻腔接种PBS作为对照组。7 d后,试验组和对照组均鼻腔接种APEC菌液。分别取对照组与试验组鸡肺脏组织在新鲜制备的4%多聚甲醛溶液中隔夜固定,然后石蜡包埋,经苏木精和伊红石蜡切片染色,观察组织学变化情况。并进行组织切片免疫荧光染色鉴定H9N2病毒感染情况。取两组鸡肺组织研磨液200μL涂布于LB营养琼脂平板上,统计菌落的总个数,发现粘附到病毒感染肺的大肠杆菌数量显著高于粘附到未感染病毒的肺。组织切片免疫荧光染色结果显示鸡肺感染了H9N2 AIV,HE病理切片显示鸡肺部肺泡结构塌陷和炎性细胞聚集,并无其他明显病理变化。体内外试验表明,H9N2病毒有利于宿主细胞对大肠杆菌的粘附,并且病毒感染后细菌粘附的增加和病理损伤之间没有必然的联系。2.H9N2病毒感染对鸡TGF-β1的表达和活性的影响通过Western blot分析和q RT-PCR试验,检测到H9N2病毒在感染DF-1细胞后胞内TGF-β1蛋白的转录水平升高,表达量增加;根据貂肺上皮细胞的增殖可被TGF-β1强烈抑制这一特性,利用貂肺上皮细胞增殖抑制试验,检测H9N2病毒感染后DF-1细胞上清中TGF-β1的活性情况。分别取接种H9N2病毒12 h、24 h、36 h、48 h后的DF-1细胞上清培养液滴加到种有貂肺上皮细胞的96孔细胞培养板孔内,24 h后经固定、染色、溶解、OD值测定后计算貂肺上皮细胞生长抑制率,以此反映H9N2病毒感染后细胞上清中TGF-β1的活性变化。结果表明H9N2病毒感染后DF-1细胞上清中TGF-β1的活性升高并且呈时间依赖性递增;同时将1周龄的SPF鸡鼻腔接种H9N2病毒,利用鸡TGF-β1 ELISA测定试剂盒和q RT-PCR检测感染了H9N2病毒的鸡肺部研磨液TGF-β1的表达量,发现H9N2病毒感染能够使鸡体TGF-β1表达增加。3.鸡TGF-β1蛋白对大肠杆菌粘附宿主细胞的影响提取感染了H9N2病毒的鸡肺脏组织RNA,反转录之后作为模板,用TGF-β1特异性引物借助PCR技术扩增TGF-β1。将目的片段与p MD18-T载体连接,测序成功后把p MD18-T-TGF-β1载体利用Eco R I和Xho I两种限制性核酸内切酶对其双酶切,将胶回收后测序鉴定正确的目的基因和pc DNA3.1(+)过表达载体双酶切,接着用工具酶T4连接酶将二者的酶切产物连接起来,之后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中进行鉴定,随后转化到BL21(DE3)感受态细胞中,将阳性转化子收集,提取质粒测定浓度,利用PCR技术对其进行鉴定后再测序验证。将验证成功的质粒利用脂质体转染至DF-1细胞中,通过胞内过表达的方法正向测定TGF-β1蛋白对大肠杆菌粘附宿主细胞的影响,结果表明过表达TGF-β1的细胞对APEC的粘附显著高于对照组;同时,以同样的方法将目的基因和p ET-28a(+)原核表达载体连接,将构建的重组原核表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中以获得p ET-28a(+)-TGF-β1大肠杆菌转化体,加入IPTG培养,37℃振荡培养至6 h,于IPTG诱导后2 h、4 h、6 h和8 h取菌液,4℃离心,收集菌体,裂解产物。利用SDS-PAGE以及Western Blot印迹分析鉴定,经分析,在SDS-PAGE中出现了分子大小为44.5 k Da的目的条带,而空白对照孔无这样的条带。Western Blot检测出分子大小为44.5 k Da的目的条带,和SDS-PAGE中检测到的结果一致。将表达蛋白用试剂盒进行纯化,之后再用SDS-PAGE检测,此时,在检测结果中只有大小是44.5 k Da的单一目的条带。将表达纯化后的目的蛋白添加至体外培养的DF-1细胞中,然后接种APEC,经孵育、离心和洗涤之后检测粘附于细胞上的APEC数,结果发现添加了TGF-β1蛋白的细胞上粘附的大肠杆菌数量比未添加TGF-β1蛋白的细胞多,并且APEC数量呈TGF-β1蛋白剂量依赖性增加。这些结果说明TGF-β1蛋白与APEC的粘附有关系。接下来,通过添加TGF-β1受体抑制剂和si RNA干扰的方法,反向验证TGF-β1蛋白的表达量的降低使细胞对APEC的的粘附能力减弱,这说明TGF-β1蛋白在大肠杆菌粘附过程中的作用是至关重要的。