肠出血性大肠杆菌(enterohermorrhangic E. coli, EHEC) O157:H7(EHEC O157)是一种重要的人畜共患传染病病原,其感染已成为全球性的公共卫生问题。自1982年该菌首次被确认为严重致病菌以来,全球很多国家和地区包括中国都多次爆发流行。EHEC O157感染宿主可导致腹泻、出血性肠炎、溶血尿毒综合症等疾病和严重并发症。由于抗生素治疗可加剧感染病情的危险,目前尚无有效的预防和控制措施。EHEC O157菌培养容易、感染力强、传播途径多样,使其极有可能作为未来军事斗争的细菌武器和生物恐怖战剂,O157菌的烈性致病因子还有可能用于基因武器的构建。美国疾病控制中心已将其列为B类生物恐怖病原体严加防范。因此,无论从公共卫生还是生物反恐的需要出发,加强其防控研究具有重大的战略意义。然而,细菌的致病机制不明确造成了目前EHEC O157感染的治疗和预防困境,深入、阐明其致病机制,对有针对性地开发治疗的创新药物、设计治疗方案、研制有效的疫苗、制定预防控制措施具有重要的理论指导作用。研究表明EHEC O157粘附于宿主肠上皮细胞、引起肠道感染部位剧烈炎症反应和粘附与擦拭(attaching and effacing, A/E)损伤是EHEC O157感染性疾病的关键。EHEC O157通过表面抗原和炎症刺激因子(OmpA、intimin等)的作用,诱导肠道感染部位剧烈炎症反应,导致电解质平衡紊乱;同时细菌紧密粘附于肠上皮细胞,通过一系列信号转导蛋白的相互作用(intimin-Tir, Tir-Cortactin, TCCP-N-WASP等),引起粘附部位肌动蛋白的聚集,导致肠微绒毛破坏、刷状元受损等肠上皮细胞特征性病例改变,细胞屏障功能破坏,进而引发感染性疾病。本研究以EHEC O157粘附于宿主肠上皮细胞、引起肠道感染部位剧烈炎症反应和介导A/E损伤过程中关键蛋白质OmpA、intimin、Tir (translocated intimin receptor)、Cortactin、TCCP (Tir coupled cytosketon protein )、N-WASP (Neural Wiskott-Aldrich syndrome protein)为研究对象,通过结构生物学和分子生物学等相关技术和手段,分析了这些重要蛋白质的结构与功能的关系,为阐明EHEC O157的致病机制提供实验和理论依据。同时,基于对intimin、EspA和Stx结构生物学和免疫学研究结果,开发新型疫苗免疫程序,为EHEC的预防控制提供有效支持。具体研究工作从下4个方面展开。1)外膜蛋白A(outer membrane protein A. OmpA) C端结构域的晶体结构解析与生化特性分析。OmpA作为细菌外膜蛋白,除了参与细菌多个生理过程,还能介导细菌与宿主细胞的粘附和细菌感染部位炎症反应,在细菌致病过程中发挥重要作用。EHEC O157 OmpA由N端、C端两个domain组成。N端domain的结构为典型的β-barrel结构,是OmpA的跨膜区,其功能主要是将OmpA锚定于EHEC O157的外膜。OmpA的C端Domain(OmpAC)可能是其发挥粘附和促进炎症反应等诸多功能的主要结构域,但其结构和具体功能尚不清楚。蛋白质的结构是实现的其功能的基础,解析蛋白质的结构是认识其功能分子机制的重要手段。本研究重组表达、纯化了OmpAC蛋白,制备了OmpAC高质量的蛋白质晶体,通过同步辐射光源衍射,收集到分辨率为2.7 (A|。)的高质量衍射数据,使用分子置换法解析得到了OmpAC的晶体结构,发现了OmpAC晶体结构中OmpAC的特征性同源二聚体组成方式(domain-swapped dimer)和swapped dimer为基础的特征性的肽聚糖结合位点,并通过生化特性分证实了OmpAC在溶液中的二聚体寡聚状态,从分子水平解释了OmpA发挥其生理功能和特殊致病功能的特征性结构基础。2) Tir IBD结构域二聚化在intimin-Tir复合体交联的作用研究. EHEC定植在肠粘膜处并能产生特有的A/E损伤,是一系列信号转导蛋白相互作用的结果。肠致病性大肠杆菌(Enteropathogenic Escherichia coli, EPEC)与EHEC类似,也能引起宿主细胞A/E损伤的形成。intimin-Tir的相互作用在EHEC和EPEC引起的A/E损伤的信号转导过程中发挥关键作用。Tir为两次跨膜蛋白,N、C端位于胞内,其胞外区(Tir IBD, intimin binding domain)与细菌的外膜蛋白intimin结合,形成intimin-Tir复合体。intiminβ-barrel结构域为二聚体,该结构域的二聚化效应能够介导intimin-Tir复合体交联,进而活化下游信号转导蛋白,引起肌动蛋白的聚集和A/E损伤。文献报道EPEC Tir IBD为二聚体,课题组前期研究中发现EHEC Tir IBD在晶体结构中也是以二聚体形式存在。提示Tir IBD的二聚体在intimin-Tir相互作用过程中发挥重要作用。本研究intimin重组表达了EHEC intimin,Tir IBD和EPEC的intimin,Tir IBD蛋白,通过凝胶过滤层析制备了EHEC intimin- Tir IBD复合体、EPEC intimin- Tir IBD复合体蛋白,通过电子显微镜技术和单颗粒结构重建技术观察到了EHEC和EPEC的intimin-Tir IBD可以形成内径约10nm的“轮胎”样寡聚复合体,这与intiminβ-barrel介导的intimin十分相似。同时,通过基因工程手段将Tir IBD形成二聚体的关键氨基酸TirEHEC 294Q、TirEPEC297Q和突变成W后,发现EHEC和EPEC Tir IBD突变体二聚化能力消失。电镜观察发现EHEC EPEC Intimin-Tir突变体的复合体不能在溶液状态下形成寡聚体复合体。结果表明,Tir IBD的二聚化在EPEC和EHEC的intimin-Tir相互作用中,具有类似intiminβ-barrel二聚化的功能,介导intimin-Tir复合物的交联,在肌动蛋白聚集和A/E损伤的信号转导过程中发挥重要作用。3)TirN、Cortactin SH3、TCCP和N-WASP的初步晶体学研究和生化特性分析。EHEC O157定植在肠粘膜处并能产生特有的A/E损伤的信号转导过程是一个系统的信号转导过程,除了需要胞膜蛋白intimin-Tir的相互作用,胞内信号分子Tir N端胞内段(TirN)与Cortactin SH3结构域相互作用、TCCP与N-WASP的相互作用在细菌引起肌动蛋白聚集、A/E损伤的过程的信号转导途径也发挥关键作用。但是它们相互作用的分子机制还不清楚。本研究重组表达了TirN、Cortactin-SH3、TCCP和N-WASP蛋白,并开展了这些重组蛋白的初步晶体学研究。取得结果:(1)制备了TirN蛋白和含硒代甲硫氨酸的TirN蛋白的晶体,分别收集到了2.4 (A|。)和2.5(A|。)的高质量衍射数据,目前正采用多波长反差散射方法解析TirN的晶体结构。(2)通过凝胶过滤层析,化学交联分析和动态光散射分析TirN在溶液状态下以二聚体形式存在,为Tir胞外区二聚化在intimin-Tir复合体交联过程中发挥重要作用提供了实验依据。(3)重组表达了N-WASP与TCCP相互作用的蛋白N-WASP160,筛选到了N-WASP160蛋白质晶体,但晶体质量较差。晶体优化工作正在进行中。(4)通过凝胶过滤层析制备了TCCP与N-WASP复合体蛋白,并对复合体进行了初步晶体生长条件筛选。这些结果为下一步继续开展A/E损伤机制研究打下了坚实的基础。4)以Intimin、EspA、Stx2B为基础的EHEC O157基因工程疫苗研究。从晶体结构证实和前期的免疫学实验表明,EHEC O157的致病因子EspA、intimin C端300个氨基酸(intimin C300)和Stx2 B亚单位(Stx2B)是较好的免疫原,单独作为抗原时,具有良好的免疫原性和免疫保护性。课题组前期通过基因工程手段将这EspA、IntiminC300和Stx2B通过linker YAPQDP和GSGGSG连接起来,构建三价重组疫苗(EspA-IntiminC300-Stx2B,EIS),并通过小鼠动物模型发现该疫苗能够诱导产生高效价的保护性免疫反应。此外,表达EIS的减毒伤寒沙门菌疫苗口服免疫小鼠能够刺激其明显保护性免疫反应。本研究制备了抗EIS多克隆抗体,通过细胞试验发现证实该抗体能够阻断EHEC O157引起HeLa的肌动蛋白聚集,为解释EIS疫苗的保护性机制提供了理论依据。此外,开发了将EIS减毒伤寒沙门菌疫苗和重组EIS蛋白疫苗相结合的联合免疫程序,发现小鼠经此程序免疫后能够产生更好的保护性免疫反应。这些结果为EHEC O157的预防控制提供有效实验和理论支持。