研究背景与目的化疗是目前临床上治疗肿瘤最常用的方法之一[1],然而大部分的肿瘤患者在经过化疗后仍会出现复发和转移[2],这也是临床上肿瘤患者死亡的主要原因[3][4]。近年来关于化疗药物与肿瘤细胞生物学特性的相关性研究发现,化疗药物顺铂作用于结肠癌等肿瘤细胞后,能够诱导肿瘤细胞发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT),促进肿瘤的迁移和侵袭[5]。前期研究结果表明化疗药物表柔比星可通过激活PI3K/AKT信号通路,诱发EMT,促进胃癌细胞的迁移与侵袭。但是,化疗药物顺铂能否通过PI3K/AKT信号通路促进胃癌细胞的迁移与侵袭尚不清楚,因此,本研究使用化疗药物顺铂处理胃癌细胞,探究顺铂对胃癌迁移与侵袭的影响及其可能的发生机制。材料与方法1.MTT法检测顺铂对胃癌细胞毒性作用取对数生长期的胃癌细胞BGC 823,以1 × 105个/ml细胞铺入96孔板中,待细胞单层铺壁率达到50%左右的时候,用0μg/ml、0.5 μg/ml、1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml的顺铂处理胃癌细胞36h,检测化疗药物顺铂对胃癌细胞的毒性作用。2.检测顺铂对胃癌细胞上皮-间质转化的影响(1)细胞形态学观察:取对数生长期的胃癌细胞BGC 823消化,铺入12孔板内,待细胞单层铺壁率达到50%左右的时候,对照组更换新鲜培养基,实验组用1 μg/ml的顺铂处理,加药36 h的时候用倒置显微镜观察并拍照,比较两组细胞的形态学变化。(2)Western blot:取对数生长期的胃癌细胞BGC 823消化,铺入直径10 cm的皿内,待细胞单层铺壁率达到50%左右的时候,对照组更换新鲜培养基,实验组胃癌细胞用1μg/ml顺铂处理,提取顺铂作用0h、12h、24h、36h的胃癌细胞总蛋白,检测肿瘤细胞发生上皮-间质化转变的标志蛋白E-cadherin、N-cadherin的表达水平的变化。3.检测顺铂对胃癌细胞迁移和侵袭能力的影响(1)划痕实验:提前用记号笔在24孔板的底部,每隔0.5 cm划线,取对数生长期的胃癌细胞BGC 823消化铺板,当细胞融合度达到100%时,用10 μl的高压灭菌枪头,用消毒过的直尺垂直于底部划线进行划痕,吸出原有培养液,PBS轻轻洗两遍,对照组加无血清培养基,实验组加含1μg/ml的顺铂无血清培养基,在倒置显微镜下拍照,记录划痕后0h和36h时细胞的迁移状态,并计算划痕愈合度,检测顺铂对胃癌细胞迁移能力的影响。(2)Transwell实验:取处于对数生长期的胃癌细胞BGC 823铺与细胞培养瓶中,待细胞单层铺壁率到50%左右时,对照组更换新鲜培养基,实验组加含有1 μg/ml顺铂的培养基,加药36 h时消化、铺入Transwell小室,在恒温培养箱中继续培养24 h,固定、染色,晾干后,在倒置显微镜下观察,并选取三个高倍视野记录侵袭到下室的细胞数量,检测顺铂对胃癌细胞侵袭能力的影响。(3)Western blot:将对数生长期的胃癌细胞BGC 823均匀的铺入直径10 cm的皿中,分别提取顺铂作用0h、12h、24h、36h的细胞总蛋白,检测顺铂对胃癌细胞转移相关的蛋白MMP-2、MMP-9的蛋白表达水平的影响。4.检测顺铂能否激活PI3K/AKT信号通路及其在胃癌细胞上皮-间质化转变、胃癌细胞迁移和侵袭能力的作用(1)Western blot检测顺铂能否激活PI3K/AKT信号通路:提取胃癌细胞在加入1 μg/ml顺铂0 h、12 h、24 h、36 h的总蛋白,检测顺铂作用后AKT、p-AKT的蛋白表达水平变化。(2)Western blot:将对数生长期的胃癌细胞BGC 823均匀的铺入直径10 cm的皿中,待细胞单层铺壁率达到50%左右时,对照组更换新鲜培养基、顺铂组加入含1 μg/ml顺铂的培养基、抑制剂组加入含有1 μg/ml顺铂+抑制剂的培养基,提取作用36h的胃癌细胞总蛋白,观察p-AKT、E-cadherin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平的变化,检测阻断PI3K/AKT信号通路后顺铂对胃癌细胞上皮-间质化转变以及对胃癌细胞迁移与侵袭能力的影响。(3)划痕实验:在细胞融合度达到100%时划痕,对照组更换无血清培养基、顺铂组加含1μg/ml顺铂的无血清培养基、抑制剂组加含有1μg/ml顺铂+抑制剂的无血清培养基,在划痕后0h、36h的时候,在倒置显微镜下观察、拍照记录,计算各组的划痕愈合度,检测阻断PI3K/AKT信号通路后顺铂对胃癌细胞迁移能力的影响。(4)Transwell实验:将对数生长期的胃癌细胞BGC 823铺入培养瓶中,对照组更换新鲜培养基、顺铂组加含1 μg/ml顺铂的培养基、抑制剂组加1 μg/ml顺铂+抑制剂的培养基,作用36 h,消化、铺入Transwell小室,放在恒温培养箱中继续培养24 h,固定、染色、晾干后,观察、记录各组侵袭到下室的细胞数量,检测阻断PI3K/AKT信号通路后顺铂对胃癌细胞侵袭能力的影响。结果:1.MTT实验表明,顺铂对胃癌细胞BGC 823具有杀伤作用,且胃癌细胞死亡率与药物浓度呈正相关。2.细胞形态学观察显示,与对照组相比,顺铂处理后部分胃癌细胞转变为间隙变大、呈梭形的间质样细胞特性,提示胃癌细胞可能发生了上皮-间质化转变;Western lot结果表明,与0h相比,顺铂作用12h、24h、36h时,胃癌细胞上皮细胞表型标志蛋白E-cadherin蛋白表达水平降低,间质细胞表型标志蛋白N-cadherin蛋白表达水平升高,提示顺铂能够诱导胃癌细胞发生上皮-间质化转变。3.划痕实验结果显示,与对照组相比,顺铂作用36 h时,划痕愈合度增加,提示顺铂可增强了胃癌细胞的迁移潜能;Transwell实验结果显示,与对照组相比,顺铂作用36h时,侵袭至下室的细胞数量增多,提示顺铂可增强胃癌细胞的侵袭潜能;Western blot结果显示,与0h相比,顺铂作用12h、24h、36h时,胃癌细胞转移相关蛋白MMP-2、MMP-9的表达水平明显升高,提示顺铂能够促进胃癌细胞的迁移与侵袭。4.Western blot结果显示,与0h相比,顺铂作用不同时间点胃癌细胞AKT表达水平基本不变,而AKT的磷酸化水平显著升高,,提示顺铂可激活PI3K/AKT信号通路。5.Western blot结果从蛋白水平显示,与对照组相比,顺铂组AKT磷酸化水平升高,与顺铂处理组相比,抑制剂组AKT磷酸化水平降低,提示抑制剂Wortmannin能够有效抑制PI3K/AKT信号通路;与对照组相比,顺铂组E-cadherin表达水平降低、N-cadherin蛋白表达水平升高,与顺铂处理组相比,抑制剂组的E-cadherin表达水平升高、N-cadherin蛋白表达水平降低,提示阻断PI3K/AKT信号通路能够部分逆转顺铂诱导的上皮-间质化转变;与对照组相比,顺铂组转移相关蛋白MMP-2、MMP-9的蛋白表达水平升高,与顺铂处理组相比,抑制剂组转移相关蛋白MMP-2、MMP-9的蛋白表达水平降低,提示阻断PI3K/AKT信号通路能够部分逆转顺铂对胃癌细胞迁移和侵袭能力的促进作用。划痕实验表明,与对照组相比,顺铂组36h划痕愈合度增加,与顺铂处理组相比,抑制剂组36 h划痕愈合度降低,进一步说明顺铂可通过PI3K/AKT信号通路增强胃癌细胞的迁移能力;Transwell实验结果显示,与对照组相比,顺铂组侵袭到下室的细胞数量明显增多,与顺铂处理组相比,抑制剂组的侵袭到下室的细胞数量又明显减少,进一步验证了顺铂可通过PI3K/AKT信号通路增强胃癌细胞的侵袭能力。结论化疗药物顺铂可通过PI3K/AKT信号通路诱导胃癌细胞发生上皮-间质化转变,促进胃癌细胞的迁移与侵袭。