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随着抗生素滥用所暴露出的弊病,国家越来越重视无抗养殖。因此,筛选具有优良性质的益生菌以替代抗生素的使用变得十分迫切。益生菌作为饲料添加剂已经成为了一个研究热点。本研究从广西多地农户自养自繁的鸡群中采集出生1周以内雏鸡的鸡粪样品,从中筛选对病原微生物有抑制作用且拥有作为饲料添加剂特性的候选菌株。评估了候选菌株对病原微生物的抑制能力、抗生素敏感性以及对模拟胃肠液、高渗透压和强酸性的耐受能力,初步分析了各菌株的抑菌物质的类型,构建了大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒。本研究经初筛和复筛得到4株(分别编号为J13、J26、J30和J31)对病原性大肠杆菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌均有较强抑制作用的益生菌,经形态学及16S r DNA序列分析初步鉴定,4种菌株均属乳酸菌,菌株J13属于屎肠球菌属(Enterococcus faecium)、菌株J26和J31均属于植物乳杆菌属(Lactobacillus plantarum),菌株J30属于乳酸乳球菌属(Lactococcus lactis)。菌株的生长曲线分析结果表明,菌株J26及J31生长趋势相似,均在培养2-4 h后进入对数期,16-20 h后进入稳定期,在培养20 h后,呈略微下降趋势,在培养24 h后趋于平稳。菌株J13及J30的对数生长期较短,菌株J13在培养12 h后进入稳定期,菌株J30在培养16h后进入稳定期。4株乳酸菌菌株对金黄色葡萄球菌相较于病原性大肠杆菌和沙门氏菌表现出了更强的抑制能力,抑菌圈直径达到了12.75-23.22 mm,2株植物乳杆菌相较乳酸乳球菌和屎肠球菌对病原微生物表现出了更强的抑制能力。研究了温度、p H及蛋白酶K对筛选到菌株胞外抑菌物质的影响,结果表明:温度及蛋白酶K对菌株胞外抑菌物质的稳定性基本无影响,而p H对菌株胞外物质有较大影响,p H越高,其抑菌能力越差,说明主要的抑菌物质受p H的影响较大。根据NCBI上已报道的细菌素的基因序列,成功从菌株J26和J31中克隆得到了细菌素基因,表明胞外抑菌物质包括细菌素。采用纸片扩散法对4株菌株进行药敏性鉴定,所有菌株对氨苄青霉素和新霉素均较为敏感。菌株J30仅对利福平表现出了耐受性,而菌株J13对包括恩诺沙星、链霉素、卡那霉素以及红霉素等大多数抗生素均较为耐受。通过体外实验,对菌株J26和J31进行模拟胃液、肠液、低p H、高浓度胆盐和高渗透压的耐受性分析,结果表明两株实验菌株在体外模拟胃液实验中,处理3 h后对数存活率均保持在80%以上;在体外模拟肠液实验中,处理3h后同样显示出了良好的耐受能力,菌株J26的对数存活率保持在75%以上,菌株J31的对数存活率保持在85%以上;两个菌株在p H 2.0和p H 3.0的环境中能正常存活;能够耐受0.25%-1%的胆盐浓度;在10%Na Cl的环境中无法正常存活,但能够耐受2%-6%Na Cl,在处理3 h后,菌株J26的对数存活数保持在7.66 Log cfu/m L以上,J31的对数存活数保持在7.32 Log cfu/m L以上。符合动物肠道定植能力的要求。以大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒p MG36e及大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒p BE-S为基础,成功构建了大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体,命名为p EL。以egfp为报告基因连接到p EL上构建重组表达质粒p EL-egfp,将重组载体电转化至J30菌株中,在抗性平板上获得重组子单菌落,经菌落PCR验证具有目的条带,后经菌液直接PCR验证未得到目的条带,表明重组质粒在J30菌株中无法稳定存在。