高粱种子休眠基因的精细定位及脆秆基因BC1的克隆与分析

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种子的休眠是植物在长期进化过程中获得的一种对环境及季节性变化的适应性,为开花植物在不同环境下的生存提供了有利条件,是影响籽粒产量、品质及加工过程的复杂数量性状,受到遗传控制、植物激素和环境因素的共同影响,种子休眠是禾本科及其他作物的重要育种目标之一。此外,植物细胞壁是地球上最主要的生物量来源之一,具有食品、饲料、纤维和生物能源原料等多种用途。高粱作为重要的生物质能源作物,其细胞壁合成相关突变体的研究有重要的生物学意义和现实意义。本研究利用野生高粱休眠品种B140与不休眠品种CK60B构建的定位群体对高粱种子休眠性QTL进行分析并对主效QTL进行了精细定位,同时从经EMS诱变的高粱品种上庄的后代群体中分离出一个茎秆机械强度降低的脆性突变体bc1,并对该突变性状的控制基因进行了图位克隆及功能分析,主要研究结果如下:1.利用B140×CK60B杂交构建的F2分离群体对高粱休眠性进行QTL分析,共检测到3个QTL,2个位于第4染色体,1个位于第7染色体,解释表型变异率为15.30%~31.20%。这3个QTL与前人定位结果不同,可能为新的QTL。2.利用B140×CK60B构建的F3、F4和F5群体中的极端交换单株,最终将休眠主效QTL qDor7精细定位到7号染色体一个约96-kb的区间内,该区间包含16个预测基因,基因功能注释、基因表达水平、测序结果显示,基闪Sobic.007G177000很有可能是亲本B140中控制种子休眠的候选基因,但仍需下一步转基因等工作的验证。3.表型观察发现,与野生型相比,脆秆突变体bcI的茎秆和叶片的机械强度明显降低,株高、株型等农艺性状无明显变化;细胞学观察显示,突变体机械组织的细胞层数变少,细胞腔变大;茎秆细胞壁成分测定显示,突变体纤维素含量较野生型降低约40%,而木质素含童提高约25%,葡萄糖含量显著降低,仅为野生型的60%,推测BC能参与了茎秆细胞壁纤维素的合成。4.遗传分析显示,突变体机械强度降低的表型由隐性单基因控制。利用高粱品种BTx623与突变体bc1构建的F2群体将BC1基闪定位在第1染色体一个约56-kb的区间内,通过对区间内的候选基闪进行测序比对,最终在基闪Sobic.001G336700第二个外显子的第344个碱基处,发现一个由C到A的单碱基突变,该突变导致bc1突变体中编码酪氨酸的密码子突变为终止密码子,蛋白翻译提前终止,因此将Sobic.001G336700作为唯一的候选基闪。5.为了验证bc1突变体机械强度降低的表型是由Sobic.001G336700基因单碱基突变引起的,将干扰载体pBC1-RNAi-1转入柳枝稷中,结果显示,与野生型相比较,所有阳性转基因植株的茎秆和叶片均表现出机械强度降低的表型,证明Sobic.001G336700就是本研究所要寻找的基闪BC1。6.RT-PCR结果表明,BC1基因在包括根、茎、叶、叶鞘和圆锥花序在内的多个部位均有表达,茎秆中的表达量最高;同一组织部位相比较,BC1基因在组织器官幼嫩时期的表达量高于成熟时期。对水稻中已克隆的细胞壁合成相关基因的高粱同源基因在突变体中的表达水平进行分析,转录组测序和RT-PCR结果显示,这些高粱同源基因在突变体中的表达有的下降有的上调,推测BC1可能通过影响细胞壁合成相关基因的表达来影响纤维素的合成和细胞壁的组装。
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