研究背景和目的结直肠癌(colorectal carcinoma,CRC)是人类常见的消化系统恶性肿瘤之一。2017年“中国结直肠癌流行病学及其预防”论坛提出:在我国,结直肠癌的发病率居恶性肿瘤第三位,仅次于肺癌和胃癌;死亡率居第五位,居肺癌、肝癌、胃癌和食管癌之后。虽然,随着结直肠癌诊疗技术以及靶向药物治疗方案的不断更新,结直肠癌患者的治疗得到了极大的改善,但晚期患者的临床预后仍不理想,复发和转移是导致结直肠癌患者死亡的主要原因。因此,阐明结直肠癌转移的分子机制,筛选和鉴定肿瘤转移中起重要作用的关键分子,对提高结直肠癌患者的治愈率,减少患者死亡率具有重要的科学意义。恶性肿瘤的发生发展是一个多因素、多途径、多基因参与的复杂生物学过程。随着高通量测序技术的不断发展和完善,对肿瘤恶性发生及演进的分子机制研究不再拘泥于蛋白编码基因,大量非编码RNA被报道在肿瘤的进展过程中扮演重要角色。HOXD-AS1属于长链非编码RNA中的反义长链非编码亚型,目前已发现其在神经母细胞瘤、膀胱癌、前列腺癌和肝癌等多种肿瘤中异常表达,参与了肿瘤细胞的增殖、侵袭与转移和肿瘤血管生成等恶性生物学进程。本课题组前期研究初步证实HOXD-AS1在结直肠癌中低表达,可抑制结直肠癌细胞体外生长、运动和迁移能力并能负向调控HOXD3基因表达。在此基础上,本研究拟进一步探讨HOXD-AS1通过调控HOXD3表达介导结直肠癌发生发展的分子机制,从LncRNA和表观遗传调控的视角,观察结直肠癌发生发展过程中的重要分子事件,为结直肠癌转移的预防和治疗提供新的策略。研究方法1、运用原位杂交、免疫组化技术明确结直肠癌中HOXD-AS1和HOXD3的表达定位,并分析其表达水平与结直肠癌患者临床病理参数和预后之间的关系。2、采用CCK-8实验、平板克隆、划痕愈合、Transwell实验以及裸鼠皮下成瘤、脾被膜注射肝转移模型等从体外、体内两个方面论证HOXD-AS1通过调控HOXD3表达对结直肠癌增殖、侵袭及转移产生的影响。3、通过RNA-Pulldown、质谱鉴定、RIP及ChIP等技术筛选与HOXD-AS1相互结合的靶蛋白,并揭示HOXD-AS1调控HOXD3表达的分子机制。4、ChIP、双荧光素酶报告实验等鉴定HOXD3作用的下游靶分子,进一步阐明HOXD-AS1在结直肠癌中发挥作用的分子通路。研究结果1、结直肠癌组织中HOXD-AS1的表达水平与患者临床病理参数和预后之间的关系原位杂交技术分析结直肠癌组织及周围正常肠粘膜上皮中HOXD-AS1的表达情况,发现HOXD-AS1表达定位在胞核内;在76.92%的周围正常肠粘膜中HOXD-AS1高表达,而结直肠癌组织中HOXD-AS1高表达率仅为36.04%。统计结果显示,HOXD-AS1在结直肠癌组织中的表达水平明显低于周围正常对照组织(χ2=48.01,P<0.001),且HOXD-AS1的表达水平与结直肠癌患者的肿瘤分化程度和TNM分期密切相关(P<0.05),而与患者性别、年龄、肿瘤大小无明显相关性(P>0.05)。Kaplan-Meier分析发现HOXD-AS1高表达的结直肠癌患者生存时间明显长于HOXD-AS1低表达的患者(92.19±5.42vs.74.32±4.58,log-rankP<0.001)。多因素COX回归分析结果显示:HOXD-AS1低表达是结直肠癌患者预后不良的独立危险因素(HR=0.581,P=0.043)。2、结直肠癌组织中HOXD3的表达水平与患者病理参数和预后之间的关系利用免疫组织化学技术分析结直肠癌组织及周围正常肠粘膜组织中HOXD3的表达情况,发现HOXD3表达也定位于胞核内;在正常粘膜组织中仅有21.9%的病例HOXD3呈高表达状态;在78.1%的病例中低表达或不表达,而在结直肠癌组织中HOXD3高表达率为81.06%。统计结果显示,HOXD3在结直肠癌组织中的表达水平明显高于周围正常粘膜组织(χ2=42.572,P<0.001),并且HOXD3表达水平与结直肠癌患者的淋巴结转移(N分期,P=0.016)和远隔器官转移(M分期,P= 0.046)密切相关,而与患者性别、年龄、肿瘤大小等无明显相关性(P>0.05)。Kaplan-Meier分析发现HOXD3高表达的结直肠癌患者生存时间明显短于HOXD3低表达的患者(75.29± 6.82 vs.94.32± 5.23,log-rankP<0.014)。多因素COX回归分析结果显示:HOXD3高表达是结直肠癌患者预后不良的独立危险因素(HR=1.862,P=0.004)。3、HOXD-AS1通过抑制HOXD3表达从而抑制结直肠癌细胞的生物学行为在稳定过表达HOXD-AS1的结直肠癌细胞中再重新过表达HOXD3,观察HOXD3在HOXD-AS1发挥作用中所扮演的角色。体内、外功能结果如下:CCK-8增殖实验结果显示:与空白对照组细胞SW620/Control相比,过表达HOXD-AS1的SW620增殖能力显著下降(P= 256.356,P<0.001),而在此基础上重新过表达HOXD3后能逆转过表达HOXD-AS1对细胞增殖能力的抑制作用(F= 91.495,P<0.001)。平板克隆实验结果显示:与空白对照细胞相比,过表达HOXD-AS1后,SW620细胞克隆形成能力明显降低(t= 10.928,P<0.001);而在此基础重新过表达HOXD3后能够使细胞克隆形成能力增强,能够部分逆转过表达HOXD-AS1对细胞克隆形成的抑制作用(t=7.862,P<0.001)。Transwell 侵袭实验:与空白对照组细胞SW620/Control相比,SW620/HOXD-AS1细胞体外迁移能力显著下降(t=7.838,P<0.001);而重新过表达HOXD3后细胞体外迁移能力显著增强(t=12.09,P<0.001)。划痕迁移实验:过表达HOXD-AS1后,SW620细胞的迁移能力较对照组的显著下调(t= 7.363,P 0.0018);而重新过表达HOXD3后细胞的体外迁移能力明显增强(t= 8.571,P=0.001)。裸鼠皮下成瘤实验结果显示:SW620/HOXD-AS1细胞皮下瘤生长速度比对照组SW620/Control细胞明显减慢(F=24.977,P<0.001);而重新过表达HOXD3后,SW620/HOXD-AS1+HOXD3细胞的生长速度显著增快(F= 19.427,P<0.001)。裸鼠肝转移模型结果显示:空白对照组中有50%(3/6)的裸鼠发生肝转移;而SW620/HOXD-AS1组中未发生肝转移(0/6),其肝转移能力明显下降(P=0.046);SW620/HOXD-AS1+HOXD3 组中有 67%(4/6)的裸鼠发生肝转移,过表达HOXD3后肿瘤细胞的肝转移能力又得到回升(P= 0.014)。4、HOXD-AS1调控HOXD3表达的分子机制4.1筛选HOXD-AS1结合蛋白通过构建体外转录质粒进行RNA-pulldown实验,下拉蛋白经质谱鉴定分析发现HOXD-AS1能与多梳抑制复合体2(Polycomb Repressive Complex2,PRC2)复合物成员之一SUZ12蛋白结合;利用SUZ12抗体及PRC2复合体中另一成员EZH2抗体进行 RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP)进一步证实SUZ12及EZH2蛋白能与HOXD-AS1 结合。4.2 SUZ12、EZH2对HOXD3表达的影响分别瞬时干扰SW620细胞株中SUZ12和EZH2基因,检测结果发现,与对照组相比,干扰SUZ12及EZH2的SW620细胞内HOXD3的表达均明显上调(F SUZ12=7.294,PSUZ12= FEZH2= FEZH2=14.49,PEZH2:=0.0096),蛋白水平同样明显升高。4.3 HOXD-AS1通过募集PRC2复合体促使HOXD3启动子区组蛋白3第27位赖氨酸位点发生三甲基化从而调控HOXD3的表达利用生物信息学预测HOXD3启动子位置,对启动子序列进行截短,利用SUZ12及EZH2抗体进行染色质免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP),实验结果证实SUZ12及EZH2蛋白能与HOXD3启动子区(-439～-23bp;-904～-792 bp;-1651～-1429 bp;-1824～-1649 bp)序列结合,而过表达HOXD-AS1后,能使SUZ12及EZH2与HOXD3启动子(-439～-23 bp;-904--792 bp)序列结合能力增强。同时,研究结果也显示SUZ12及EZH2使组蛋白3第27位赖氨酸位点发生三甲基化(trimethylation of Lys27 of histone 3,H3K27me3),是其抑制HOXD3转录的方式之一。5、HOXD3可激活Integrin Subunit Beta(ITG83)基因转录HOXD3是一种转录因子,利用生物信息学软件Promoter Database预测分析发现,HOXD3能结合的DNA序列中包含ITGB3基因的启动子;在SW620细胞中干扰HOXD3后,ITGB3的mRNA表达水平显著下降(t=11.638,P=0.007),而过表达HOXD3时,ITGB3的mRNA表达水平又显著上调(t=10.517,P=0.009),蛋白变化趋势与mRNA变化趋势一致。根据生物信息学预测结果,设计ITGB3启动子序列PCR扩增引物,利用HOXD3抗体行ChIP实验,证实HOXD3蛋白能与ITGB3启动子结合。双荧光素酶报告实验显示,在SW620细胞中过表达HOXD3后,pGL3-ITGB3的荧光素酶活性显著提高(F=279.4,P<0.001);在293T细胞中得到相同结果(F=75.17,P<0.001);证实HOXD3作为转录因子能够激活ITGB3的转录。研究结论1、HOXD-AS1在结直肠癌组织中异常低表达,其表达水平与肿瘤的分化及TNM分期密切相关,HOXD-AS1低表达与结直肠癌患者的不良预后相关。2、HOXD3在结直肠癌组织中异常高表达,其表达水平与肿瘤转移相关,HOXD3高表达提示患者生存预后不良。3、HOXD-AS1可负向调控其正义基因HOXD3的表达,HOXD-AS1过表达抑制结直肠癌细胞生长、运动和转移能力依赖于HOXD3的异常表达。4、HOXD-AS1通过与SUZ12、EZH2结合募集PRC2复合物,诱导HOXD3启动子区发生H3K27me3,负向调控HOXD3表达。5、HOXD3 作为转录因子激活 ITGB3 的转录,三者形成HOXD-AS1/HOXD3/ITGB3调控轴抑制结直肠癌的发生发展。