论文部分内容阅读
目的发现新的胞质DNA识别蛋白;探讨AUF1与DNA结合的机制。方法（1）首先运用核质分离技术将MEF细胞的细胞核与细胞质分离。然后通过生物素-亲和素亲和层析技术分离胞质DNA结合蛋白。以未加生物素标记的DNA和生物素标记的poly（dA）为对照样本,以加入生物素标记的ISD为实验样本,通过“银染-质谱”和“复合物-质谱”技术寻找三者之间的差异蛋白。两次质谱分析均鉴定出AUF1。（2）构建p45AUF1原核和真核表达载体,分别获得GST-AUF1和GFP-AUF1。将GST-p45AUF1和GFP-p45AUF1分别与生物素标记的dsISD、ssISD-F、ssISD-R、poly（dA）共孵育,用链霉亲和素偶联的珠子下拉蛋白。通过生物素-亲和素结合实验证明p45AUF1是否与ISD结合。（3）运用CRISPR/Cas9技术建立AUF1基因敲除的HEK 293T细胞系。通过Western Blot实验检测AUF1基因敲除情况。（4）设计AUF1结构缺失体的基因特异克隆引物,用高保真的DNA聚合酶扩增相应的片段,将上述的片段连接到pBOB-c-flag载体中。（5）将构建的pBOB-c-flag-AUF1四个亚型的质粒转染至HEK293T-AUF1K/O细,用免疫荧光技术观察四个亚型的定位情况。（6）将表达AUF1四个亚型以及一系列flag-截短AUF1重组质粒转染至HEK 293T-AUF1 K/O细胞,48h后收集细胞。在裂解离心后的上清与生物素标记的ISD混合物中,用亲和素偶联的珠子下拉蛋白。通过生物素-亲和素结合实验研究AUF1结合ISD的结构域。（7）将表达AUF1全长以及一系列flag-截短AUF1重组质粒分别与GFP-AUF1质粒共转至HEK 293T-AUF1 K/O细胞,48h后收集细胞,裂解细胞并离心。收集上清,并加入偶联了flag抗体的琼脂糖,通过免疫共沉淀实验证明AUF1的自身结合情况。结果（1）利用质谱技术发现AUF1是潜在的ISD结合蛋白。（2）体外结合实验证实AUF1能与ISD结合,并且与ssISD的结合要强于与dsISD的结合。（3）成功构建AUF1基因敲除细胞系,AUF1敲除效果显著。（4）p37和p40主要定位于细胞质中,p42和p45主要定位于细胞核中。（5）AUF1的四个亚型与dsISD和ssISD均有结合。（6）当RRM1或RRM2缺失时,AUF1与ISD的结合减弱;当RRM1和RRM2都缺失时,AUF1与ISD不结合。（7）免疫共沉淀实验证实AUF1可以自我结合。（8）当RRM1或RRM2缺失时,flag-AUF1与GFP-AUF1仍可以结合;当RRM1和RRM2都缺失时,flag-AUF1与GFP-AUF1不结合。结论（1）AUF1可以结合ISD,外显子7抑制AUF1与双链ISD的结合。。（2）AUF1通过RRM1和RRM2两个结构域识别并结合ISD。（3）AUF1通过RRM1和RRM2两个结构域自身结合。