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体细胞克隆效率主要取决于供体细胞核是否被完全重编程,而供体细胞重编程涉及去除表观遗传标记,将其逆转为未分化的状态,获得可重新分化成各种类型细胞的能力[1]。组蛋白3第9位赖氨酸三甲基化(H3K9me3)依赖的异染色质是体细胞发生完全重编程的重大障碍[2]。花斑抑制因子同源物(suppressor of variegation3-9 homologl/2, SUV39H1/2)基因编码特异性催化H3K9me3形成的组蛋白甲基化转移酶,促进染色质浓缩形成异染色质,调控基因转录。为了探究SUV39H1/H2基因在体细胞重编程过程中的作用,本研究采用RNA干扰(RNAi)技术抑制德保猪耳成纤维细胞SUV39H1/H2基因表达,并以之为核供体,探究对猪体细胞核移植早期胚胎发育潜能的影响。以探索提高克隆胚胎发育潜能及克隆动物生产效率新途径。一、 SUV39H1/H2基因表达载体构建及其shRNA干扰效率验证1.为了获得具有显著抑制SUV39H1/H2基因表达的shRNA片段,本试验首先克隆获得德保猪SUV39H1基因第二外显子和SUV39H2基因完整的ORF序列,分别构建其真核表达载体并在293T细胞中表达;SUV39H1基因第二外显子序列与野猪SUV39H1基因具有100%同源性,且在牛、绵羊、马等物种中保持较高的序列同源性；SUV39H2基因编码的氨基酸序列与牛、人和黑猩猩相比,同源性分别为97%、96%和96%,说明SUV39H2蛋白在不同物种之间表现出较高的保守性。2.根据文献报道的SUV39H1/H2基因siRNA序列,分别构建其相应的pSicoR-GFP-shRNA’慢病毒表达载体。将靶基因表达载体与相应的干扰载体按照1：3的质量比共转染293T细胞,采用qRT-PCR方法分析比较shRNA的干扰效率。结果显示,SUV39H1-shRNA1/2对SUV39H1基因的抑制效果显著(P<0.05),分别为65.08%、40.11%。SUV39H2-shRNA1/2对SUV39H2基因的抑制效果亦显著(P<0.05),分别是39.29%、93.59%。选择SUV39H1-shRNA1和SUV39H2-shRNA2进行后续研究。二、 SUV39H1/H2基因表达抑制对猪成纤维细胞生长的影响为了探究SUV39H1/H2基因表达抑制对猪成纤维细胞生长的影响,利用脂质体法分别包装SUV39H1/H2基因shRNA慢病毒,将两种病毒以滴度比为1：1混合,以不同MOI值(300/600/1200)的病毒感染德保猪耳成纤维细胞,测定各组细胞的生长曲线；收集MOI 600病毒感染组细胞,采用qRT-PCR方法分析相关基因的表达。结果显示,与未处理组相比,MOI 300和600病毒感染可以明显促进细胞生长(P<0.05)；MOI 1200组细胞生长受到抑制,在对数生长期,细胞增殖速度也较另外两个感染组缓慢。qRT-PCR检测结果显示,在MOI 600病毒感染组细胞中,SUV39H1/H2基因的抑制程度分别为64.18%、59.28%,G9A、HDAC1、 DNMT1基因的表达显著降低(P<0.05),HAT1基因表达显著升高(P<0.05)。细胞周期相关基因CyclinA2、CyclinB、PCNA的表达显著升高(P<0.05),CyclinD1、CyclinD2基因的表达显著降低(P<0.05)。三、SUV39H1/H2基因表达抑制对猪体细胞克隆胚胎发育的影响1.利用免疫组化方法分析了H3K9me3在猪早期胚胎中的表达模式。结果显示,猪孤雌激活和核移植早期发育胚胎(PA和SCNT)的各个时期均能检测到H3K9me3表达,但表达趋势不同。H3K9me3水平在PA胚胎1-细胞期至8-细胞期升高,8-细胞期达到最高水平,之后又下降；SCNT胚胎H3K9me3的水平除了在2-细胞期至4-细胞期有所下降以外,在1-细胞期至桑椹胚期总体呈升高趋势,桑椹胚期至囊胚期下降。2.采用qRT-PCR方法分析调控H3K9me3表达相关酶基因在猪早期胚胎中的表达模式。结果发现,SCNT组胚胎的SUV39H1/H2、KDM4D基因表达水平均高于PA组,且在2-细胞期胚胎的表达水平均极显著升高(P<0.01)；SCNT组的SETDB1基因表达水平在2-细胞期胚胎与PA组差异不显著(P>0.05),在4-细胞期至囊胚期胚胎显著高于PA组(P<0.05)。3.以MOI 300和600的病毒感染猪成纤维细胞,挑选表达绿色荧光蛋白的细胞进行核移植试验,统计胚胎分裂率、囊胚率、囊胚平均细胞总数。结果显示,与未处理组相比,SUV39H1/H2基因表达抑制能够显著提高猪核移植胚胎的分裂率、囊胚率和囊胚平均细胞总数(P<0.05)。比较两个病毒感染组结果发现,随着SUV39H1/H2基因表达抑制程度的增加,表达绿色荧光的细胞数目增多,核移植胚胎的囊胚率显著升高(P<0.05),胚胎分裂率、囊胚平均细胞总数没有显著变化(P>0.05)。以上研究结构表明,在一定程度上,抑制SUV39H1/H2基因的表达能够促进德保猪耳成纤维细胞的生长,提高猪核移植胚胎分裂率和囊胚率,增加囊胚平均细胞总数。