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前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤。2012年全世界前列腺癌新确诊病例110万,位居各瘤种第二位。在发达国家前列腺癌新发病例位居各瘤种首位,在发展中国家位居第4位。随着中国经济的发展、人口老龄化和人们生活方式的改变,前列腺癌发病率呈逐年上升趋势。目前,前列腺癌筛查、早期诊断、手术、放疗、化疗、内分泌和免疫治疗等综合诊疗模式使患者的死亡率逐渐降低,但仍有相当一部分患者会出现复发和转移。因此,需要不断探索前列腺癌复发和转移的分子机制,寻找潜在的干预靶点。近年来研究发现,离子通道在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用。临床上大约有13%的药物都作用于离子通道,用于治疗心血管和神经系统异常等多种疾病。因此,探索将离子通道作为某些肿瘤治疗的潜在靶点或预测指标具有重要的研究意义。BKCa是广泛表达于心肌、血管平滑肌、神经系统等全身多种组织和器官的大电导钙激活钾通道。BKCa在可兴奋细胞中主要通过调节细胞膜电位和细胞内钙信号,参与调控血管舒缩性和神经兴奋性等生理功能。近年来研究发现,BKCa在多种肿瘤中呈高表达并参与了肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭等许多恶性生物学行为。BKCa的编码基因在晚期前列腺癌中的扩增率达16%,而在早期患者中无扩增。目前研究发现,BKCa可以促进前列腺癌的增殖,但其分子机制尚未完全阐明。此外,除细胞增殖外BKCa是否也参与了前列腺癌的转移、BKCa在体外的促肿瘤作用是否也能在体内实现这些问题均有待回答。本课题从前列腺癌细胞系、荷瘤裸鼠体内和临床肿瘤组织和三个层面检测了BKCa的表达和功能,初步探讨了BKCa表达调节对前列腺癌细胞增殖、迁移、侵袭、体内成瘤和转移的影响及其分子机制。第一部分BKCa在前列腺癌细胞和组织中的表达目的:比较BKCa在前列腺癌细胞和组织与正常细胞和癌旁良性组织中的表达差异,分析BKCa表达与前列腺癌临床分期和肿瘤增殖标志物Ki67的相关性。方法:采用实时荧光定量PCR、Western blot和细胞免疫荧光检测BKCa在前列腺癌细胞PC3和C4-2和正常前列腺上皮细胞RWPE-1中的表达。采用实时荧光定量PCR、Western blot和免疫组织化学法检测了前列腺癌组织与癌旁良性组织中BKCa的表达差异。采用免疫组织化学法检测了前列腺癌组织中BKCa的表达与肿瘤分期和Ki67表达的相关性。结果:定量PCR和Western blot结果显示BKCa的mRNA和蛋白质在前列腺癌组织和细胞系中的表达均高于癌旁良性组织和正常前列腺上皮细胞系。免疫组化结果提示,BKCa在前列腺癌组织中的表达与增殖标志物Ki67呈正相关(r=0.461,p=0.0032),且BKCa的表达随着前列腺癌分期的提高而增加,IV期前列腺癌中BKCa的表达明显高于I-III期。结论:BKCa在前列腺癌组织和细胞中的表达明显高于癌旁良性组织和正常上皮细胞,前列腺癌组织中BKCa与Ki67的表达呈正相关,且肿瘤分期越晚BKCa表达越高。第二部分BKCa表达调节对前列腺癌生长和转移的影响目的:探讨BKCa表达调节对前列腺癌生长和转移的影响方法:通过质粒载体介导的BKCa上调体系和慢病毒载体介导的BKCa稳定沉默体系实现对前列腺癌PC3和C4-2细胞系中BKCa表达的上、下调,并采用MTT、EdU、平板克隆、细胞划痕、Transwell迁移和侵袭实验检测BKCa表达上、下调对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。采用前列腺癌PC3细胞构建裸鼠皮下种植瘤模型和细胞尾静脉注射肺转移模型,检测BKCa表达下调对肿瘤生长和转移的影响及肿瘤组织中Ki67的表达变化。结果:BKCa表达上调后,前列腺癌细胞的细胞活力、DNA合成效率和克隆形成能力较对照组明显提高,细胞划痕愈合率、迁移和侵袭的细胞数量也较对照组显著提高;BKCa表达下调则会抑制前列腺癌细胞的上述生物学行为。体内研究显示,BKCa表达下调后PC3细胞裸鼠种植瘤体积、质量和Ki67表达较对照组明显降低,尾静脉注射的PC3细胞肺脏转移数目明显减少。结论:BKCa表达上调可促进前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力;BKCa表达下调则会抑制前列腺癌细胞的上述生物学行为,并抑制肿瘤在裸鼠体内生长和转移。第三部分BKCa调控前列腺癌生长和转移的分子机制目的:探讨BKCa调控前列腺癌生长和转移的分子机制方法:采用膜片钳技术验证BKCa激动剂NS1619和抑制剂IBTX对PC3细胞钾电流的作用,并检测BKCa活性调节对前列腺癌增殖和迁移的影响。采用激光共聚焦免疫荧光和免疫共沉淀技术检测BKCa与整合素αvβ3和FAK的共定位和相互作用情况,通过Western blot检测BKCa表达调节对整合素αvβ3、FAK和p-FAK(Tyr397)表达的影响。采用整合素αvβ3封闭抗体LM609和FAK抑制剂Y15处理BKCa表达上调的PC3细胞,检测细胞增殖和迁移变化,验证整合素αvβ3/FAK通路在BKCa调节前列腺癌细胞增殖和迁移中发挥的作用。采用免疫荧光技术检测临床前列腺癌标本中的BKCa和p-FAK(Tyr397)表达的相关性。结果:BKCa的离子通透功能在促进前列腺癌细胞增殖和迁移中发挥一定作用但并非主要机制。BKCa与整合素αvβ3和FAK存在共定位和相互作用,BKCa表达调节对整合素αvβ3和FAK的表达无影响,但可通过与整合素αvβ3和FAK形成功能复合体,加强后两者间的信号偶联从而增加FAK的磷酸化,最终促进PC3细胞的增殖和迁移。阻断αvβ3/FAK信号通路后可明显削弱BKCa表达上调对细胞增殖和迁移的促进作用。在临床前列腺癌标本中,BKCa和p-FAK(Tyr397)的表达呈正相关(r=0.517,p=0.0008)。结论:BKCa通过与FAK和整合素αvβ3形成功能复合体并加强后两者之间的信号偶联促进前列腺癌细胞的生长和转移。