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丙酮酸激酶M2(PKM2)是糖酵解过程的限速酶,催化将磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸基团转移至ADP,生成丙酮酸和ATP的反应。近年来研究发现,PKM2是调控肿瘤细胞产生Warburg效应、促进肿瘤增殖的关键蛋白之一,但其作用机制至今仍未阐明。本文利用相互作用蛋白质组学技术,发现在DNA损伤的过程中,细胞核内的PKM2可以与P53发生相互作用,在此基础上,我们研究了二者相互作用的机制及其在肿瘤细胞应对DNA损伤反应时所产生的体内、外效应。本文主要取得了以下研究成果:1)通过co-IP(免疫共沉淀)、分子筛分离并结合质谱技术,我们在乳腺癌细胞株MCF7中发现PKM2与P53等DNA损伤反应过程中的重要信号分子发生相互作用。2)通过co-IP、GST-Pulldown和免疫荧光手段,我们证实PKM2在核内与P53共定位并发生直接相互作用。进一步通过GST-Pulldown等技术,鉴定出PKM2蛋白主要通过C功能域和P53蛋白的DNA结合功能域相互作用。3)通过Ch IP(染色质免疫共沉淀)、luciferase报告基因等方法发现PKM2通过抑制P53与其反应原件的结合(P53 Response Element)下调细胞周期抑制蛋白P21的表达,导致细胞周期在DNA损伤条件下不能停滞在G1期进行有效修复,从而继续增殖,表明PKM2作为P53的共抑制因子可促进损伤细胞继续生长。4)在小鼠移植瘤模型中发现,敲除PKM2的肿瘤在化疗药物Etoposide处理后生长受抑制,进一步在体内证实PKM2通过调控P53影响肿瘤细胞在DNA损伤发生时的增殖。5)在超过50%的肿瘤中存在P53基因的突变。肿瘤中P53的突变以点突变的形式为主,突变热点集中在DNA结合结构域,主要造成P53蛋白调控转录等功能的改变。为了进一步阐明PKM2对P53功能的影响,我们选取了R248Q这一肿瘤细胞中突变频率最高的P53突变体,对两者的相互作用及其潜在的效应进行研究。在表达P53-R248Q的人类急性早幼粒白血病细胞系NB4细胞中,通过co-IP、免疫荧光等实验我们观察到PKM2与突变体P53-R248Q同样存在相互作用。进一步实验发现,P53蛋白可以增加PKM2的四聚体构象的比例,并影响PKM2的丙酮酸激酶的活性。综上所述,本研究发现,PKM2可作为P53的共抑制子,通过与P53发生相互作用进而下调P53靶基因P21的转录,从而影响肿瘤在DNA损伤条件下的生长。在P53突变的肿瘤细胞中PKM2仍然可与P53发生相互作用,并影响PKM2的构象及丙酮酸激酶的活性。该研究首次阐明了PKM2在细胞核内可作为共抑制子调控P53而影响肿瘤细胞增殖,揭示了PKM2促进肿瘤发生发展的新机制。同时,本研究为通过靶向PKM2治疗肿瘤提供了新的依据。