癌症,一个世界性的医学难题,自上世纪以来一直困扰着我们,据研究表明,全球癌症患者及相应的死亡病例在中国呈现出明显的集中趋势,且新增病例排行中中国稳居第一位。基于传统治疗手段的无法彻底根治性、局限性及可能产生的耐药性,寻求更安全有效的治疗方法一直是急需解决的难题。在众多已知的药物中,多肽类药物凭借其显著的活性、小分子量具有的灵活性更易于透过各种管壁,更好的稳定性等特点受到越来越多的关注。蜂毒肽是一种从蜂毒中提取出来的肽类,为蜂毒发挥药理作用的主要成分,具有很强的表面活性,能够直接作用于细胞膜,使细胞裂解致死,此外还具有抗炎、抗菌、抗病毒及抗肿瘤等作用。当应用于癌症治疗时,其尚不明确的的作用机制推测可能为:直接杀伤和诱导凋亡肿瘤细胞、间接影响生物学行为改变其所处环境,进一步对肿瘤细胞产生抑制。在具备显著优点的同时,蜂毒肽也具有一定的缺陷性,对红细胞的强溶血作用,限制了其在临床的应用。而基于蜂毒肽对细胞的溶血现象,对蜂毒肽进行改造后,将极大影响蜂毒肽的抗肿瘤活性,故解决蜂毒肽的溶血现象的同时保证其高活性这一问题是目前所需解决的。本实验中,通过置换蜂毒肽氨基酸序列的中的氨基酸,使用化学合成方法合成蜂毒肽,构建蜂毒肽异构体,筛选出具有较高活性且无溶血现象的肽链。第一部分蜂毒肽的设计、合成对蜂毒肽的结构进行设计,采用Fmoc固相合成多肽的方式合成蜂毒肽,分析其纯度,在合成的肽链中进行筛选,筛选出既无溶血现象且保有较高的活性的肽链。第二部分合成产物对肿瘤细胞的作用研究AP-16的溶血实验表明,作用于红细胞的AP-16不存在溶血现象。通过MTT检测AP-16对MCF-7细胞及A549、Hela、HepG2、HO-8910PM细胞的抑制作用,结果表明,AP-16对不同的肿瘤细胞具有不同的杀伤抑制作用,且效果良好,其IC₅₀值分别为9.16 nM、11.20 nM、10.59 nM、10.60 nM、10.48 nM结果表明蜂毒肽变构体在解决其溶血现象的同时仍保有良好的抗肿瘤效果。本实验用FITC对蜂毒肽变构体AP-16进行标记,同时用Hochest33342对给药48 h后的细胞进行染色,采用Mito tracker red cmxr对肿瘤细胞的线粒体进行标记,在激光共聚焦显微镜下进行观察。结果显示为MCF-7细胞内的线粒体被荧光探针标记显示为红色,同时被Hochest33342染为蓝色的细胞核包围,被FITC标记的AP-16则发出黄绿色荧光,位于细胞核周围和线粒体上,表明AP-16作用于肿瘤细胞,进入细胞,继而诱导细胞凋亡。为观察给药后肿瘤细胞核的变化,将MCF-7肿瘤细胞制成细胞爬片,加入AP-16作用48 h后,DAPI染色,固定,荧光显微镜下观察,有细胞核聚集皱缩的变化,证明在AP-16的作用下产生了凋亡。通过流式细胞仪检测MCF-7细胞周期及凋亡,根据细胞周期可知AP-16对处于G1期的细胞产生阻滞作用,从而诱导细胞凋亡,根据流式测细胞凋亡结果得出不同的给药浓度呈现出不同的凋亡率,两者之间呈剂量依赖关系。对MCF-7细胞进行细胞愈合实验,实验表明,AP-16对细胞的愈合具有抑制作用,且与药物浓度有关。用Transwell对MCF-7细胞进行肿瘤侵袭实验,结果表明AP-16对肿瘤细胞的侵袭转移有一定的影响作用。综上所述,本研究成功合成了21条蜂毒肽变构体,并从中筛选出既没有溶血作用且具有较高的抗肿瘤活性的AP-16,通过体外实验对其抗肿瘤机制进行了一定的研究,最终证明了AP-16在没有溶血作用的基础上,对多种肿瘤细胞有着良好的抑制作用,为蜂毒肽变构体方向的研究提供了一定的基础。