研究背景和目的软组织缺损的修复与填充一直是整形外科医生所面临的主要课题。其主要的原因有先天性畸形、后天的生长发育不良、外伤、体表肿瘤切除术后、伴随衰老而发生的组织容量的丢失等。根据具体情况在临床上可分为整形手术及美容手术两大类。针对这一问题的解决方案有：邻位皮瓣、游离皮瓣移植技术及软组织材料填充技术。传统的皮瓣移植技术存在着供区选择与损伤的问题,而且最终所能达到的修复效果并不能令人满意。应用各类软组织材料的填充方法存在着生物安全性与长期有效性方面的问题。1893年,Neuber首次应用上臂的一小块脂肪重建因结核性骨炎导致的面部凹陷区。1980年,脂肪抽吸技术出现,使得颗粒脂肪移植技术应用于临床更为简便。自体脂肪移植具有供区广、低损伤、操作简便、塑性效果好等优点,使得这项技术被广大整形外科医生与患者所青睐。目前,临床上所采用的颗粒脂肪移植技术主要基于Coleman脂肪移植技术,分别包括以下内容：1、脂肪的获取,根据所需脂肪的量按一定比例灌注肿胀液,在灌注充分后采用26-40Kpa的负压抽吸脂肪；2、脂肪的收集,通过离心技术将所获取的脂肪进行纯化(3000rpm/min,3分钟)；3、采用多点、多隧道、多平面的方法进行脂肪移植注射。另外,还对脂肪供区及注射针管孔径都进行了详细的研究比较以达到最佳移植效果。尽管如此,颗粒脂肪移植技术除具有供区广、低损伤、操作简便、塑性效果好等优点外,还存在术后吸收率高达40%-60%等难以解决的问题。因此,如何降低颗粒脂肪移植后的吸收率以提高脂肪移植术后保留率,从而控制远期填充效果,是整形外科临床应用及理论基础研究中的一个重大难题。通过研究脂肪组织的具体结构,我们可以发现,脂肪组织有着相当丰富的血液供应,每个脂肪细胞本身有着至少一条毛细血管供应,与等体积的横纹肌相比较,其血运更为丰富。此外,脂肪细胞内由大量脂滴及少量的细胞器构成,这种特殊的细胞结构决定了脂肪细胞的高耗能性。在颗粒脂肪移植各过程中,脂肪的获取、收集以及移植等操作对脂肪细胞存在一定的损伤；与此同时,对脂肪组织内部的毛细血管的损伤相当严重以致只能残留少部分的血管片段。最终决定脂肪移植中活的脂肪细胞只能从移植部位获得相应的营养供应。脂肪移植早期,移植脂肪与受区没有建立良好的血液供应,脂肪细胞的营养供应便只能由组织间液的渗透而来,然而组织间液的渗透能力有一定限制,只能渗透约150-200微米。因此,理论上在组织间液渗透范围以外且无法及时构建有效血供区域内的脂肪细胞便由于缺血缺氧而发生坏死,从而影响最终脂肪移植的长期保留率。但是经过对脂肪移植的长期标本进行观察发现,脂肪移植物中最终存活下来的区域并不局限于由外周往内部区域的150-200微米区域。这一结果提示在脂肪移植的后期过程中,存在着脂肪组织的新生与血运的重建。倘若能对脂肪移植后的早期血运重建机制及脂肪组织的新生模式进行详细的研究,将能让我们更好的理解脂肪移植并对其存活率方面有着更为科学的评估,这将在改善脂肪移植后长期存活率方面有着重要的意义。由于脂肪细胞耐受缺血缺氧的能力有限及组织间液渗透范围的限制,及时而有效的完成早期移植物血运的重建能够极大程度的减少移植脂肪细胞的死亡程度,从而提高颗粒脂肪的远期保留率。然而,对于颗粒脂肪移植后如何重建血运这一问题尚不清楚。在颗粒脂肪的获取与移植过程中,不可避免的将部分地血管片段也同时移植入脂肪受区,这部分的血管片段是否能够直接与受区的血管直接贯通或者降解为单一的内皮细胞参与后期的血管新生过程,还是完全不参与后期的血运重建过程,具体以何种方式参与新生脂肪组织内的血运重建仍需进一步讨论。对于颗粒脂肪移植后的存活机制,主要存在两种观点：一种是宿主取代论,移植后的颗粒脂肪并不能存活,而是发生坏死并释放脂滴,由宿主来源的巨噬细胞吞噬其脂滴后,变为成熟的脂肪细胞,并取代原有的移植细胞；一种为细胞存活论,颗粒脂肪移植后,部分脂肪细胞能够通过组织间液的渗透作用而存活下来,不能及时获取营养供应的脂肪细胞发生坏死,并最终被宿主来源的巨噬细胞所清除。我们课题组前期试验发现,颗粒脂肪移植后远期存活的脂肪细胞内巨噬细胞标记CD68呈阴性表达,且在脂肪组织边缘区域呈弱表达。由此可见,传统的宿主取代论无法解释脂肪组织的新生过程,我们所面临的两个主要问题有：1、长期移植的颗粒脂肪组织内来源,到底是由宿主来源的细胞参与增殖分化而成还是移植脂肪内部细胞渡过缺血缺氧期而再次增殖分化而来?2、参与新生组织构成的主要是由哪一类细胞参与完成?基于以上几个科学问题,本实验先构建脂肪移植模型,即分别将等量C57/GFP小鼠整块脂肪和颗粒脂肪移植至GFP/C57小鼠背部。选取C57小鼠与GFP小鼠的颗粒脂肪互换移植组,分析不同时间点的组织块荧光百分率以判断组织块内部具体构成的组织学来源；并具体阐述其随时间的变化规律。选取整块移植组和颗粒移植组,观察并比较两种不同移植组中的长期保留率以探讨脂肪组织内部血运重建的具体机制；另外,通过全组织染色的方法判断组织块内部的主要活性细胞。这对于深入了解颗粒脂肪移植后的脂肪新生机制、血运重建模式及具体的细胞来源有重要意义。方法采用两种不同的小鼠(C57小鼠/GFP小鼠),将其由两种小鼠中获取的等量脂肪进行两组处理,即整块移植和颗粒移植。最终可分为四组：a、整块的C57小鼠脂肪移植至GFP小鼠背部;b、整块的GFP小鼠脂肪移植至C57小鼠背部；c、C57小鼠的颗粒脂肪移植至GFP小鼠背部；d、GFP小鼠的颗粒脂肪移植至C57小鼠的背部。1、颗粒脂肪移植后脂肪新生的组织学来源基于以上颗粒脂肪移植互换模型的c组及d组,分析不同时间点荧光面积所占冰冻切片整体面积的百分比,由c组面积百分比可以推算出移植物内部宿主来源的组织所占比例,由d组荧光面积百分比可以推算出移植物内部移植物来源组织所占百分比,通过观察这两条曲线的变化趋势,最终以探讨颗粒脂肪移植后具体的组织学来源。2、颗粒脂肪移植后早期血供重建机制的探讨基于所有分组,在固定时间点对整块移植组与颗粒移植组的大体标本进行观察,判断两种不同的脂肪移植方式对移植效果的影响。类似于方法1中所述,计算出整块移植物内宿主与移植物来源比例的变化趋势,并由此分别推导出两类移植方法下的坏死组织比例变化趋势。另外结合前期相关试验分析脂肪移植过程中细胞的存活情况,以探讨颗粒脂肪移植过程中血运重建的机制。3、颗粒脂肪移植后组织新生的细胞学基础选取颗粒脂肪移植后4W的组织块,进行全组织学染色以观察细胞核、GFP、CD34的表达情况,判断在脂肪组织新生过程中的主要活性细胞,同时采用Ki67进行免疫组化标记,以观察此时细胞的增殖活性如何,从而探讨组织新生过程中的细胞学基础。4、统计学处理数据以均数±标准差(x±s)表示,使用统计软件SPSS13.0进行数据处理。两组之间比较采用配对t检验；不同时间点的差异采用协方差分析。结果1、结合c/d组可以发现,在颗粒脂肪移植组中,由移植物来源的组织成分随时间变化逐渐减少,1-4W下降趋势十分明显,4-6W下降较为平缓,6-8W下降速率加快并最终只有15%比例,由宿主来源的组织成分由1-4W逐渐上升至约40%左右,4-6W无上升较为平缓,6-8W进一步上升并最终在70%左右水平。2、分别对整块脂肪移植与颗粒脂肪移植4W、8W的移植物进行大体标本观察,发现颗粒脂肪移植的长期效果要要优于整块脂肪移植组,主要体现在组织块大小及表面血管分布情况；同时发现,整块脂肪移植8W的坏死区域百分比约为60%,颗粒脂肪移植8W的坏死区域百分约为20%。3、这部分细胞主要为hoechst+/GFP+/CD34+细胞,表明这部分组织中的细胞来源主要为宿主来源的CD34+细胞,免疫组化染色发现这部分细胞表达为Ki67阳性,具有良好的增殖活性。此外,也发现这部分细胞能够参与血管的新生过程。讨论自体脂肪移植技术因具备众多优点而广泛应用于临床,但是术后的吸收和不可预知性是限制其应用的主要问题,其根本原因在于我们对脂肪移植后的具体存活机制并不十分清楚,其中包括：1、脂肪移植后期新生脂肪组织的来源；2、脂肪移植后的血运重建模式；3、由哪一类主要细胞完成组织新生?本实验将C57/GFP小鼠的脂肪进行互换移植,总共分为四个小组,八个时间点进行观察。在不同时间点对分别对四组行冰冻切片,分析荧光面积变化趋势,根据c组荧光面积百分比变化趋势可以得出颗粒脂肪移植术后宿主来源的组织成分所占比例的变化趋势；根据d组荧光面积百分比变化趋势可以得出颗粒脂肪移植术后移植物来源的组织成分所占百分的变化趋势。依据c/d两条曲线变化情况可以大致推算出颗粒脂肪移植术后在每个时间点坏死区域所占据的比例。我们实验结果发现在颗粒脂肪移植术后移植物来源的组织成分总体呈现出下降趋势,1-4W下降趋势十分明显,4-6W下降较为平缓,6-8W下降速率加快并最终只有15%比例,由宿主来源的组织成分由1-4W逐渐上升至约40%左右,4-6W无上升较为平缓,6-8W进一步上升并最终在70%左右水平。可以得出颗粒脂肪移植组8W的坏死比例约占15%。由此我们发现,后期移植物内的主要组织学来源为宿主。对比整块移植与颗粒移植的后期标本大体观,可以发现在颗粒移植的脂肪块后期质地及体积要优于整块脂肪移植组,同时结合荧光面积分析可以间接推导出两组中的坏死区域变化趋势,可以发现整块脂肪移植组的远期坏死率要明显高于颗粒脂肪移植组的坏死率。整块脂肪与颗粒脂肪的最大区别在于,整块脂肪中存在着较为完整的脂肪结构,包括原有的血管网络,而颗粒脂肪移植组的脂肪结构则被完全破坏,是由等量的整块脂肪组织充分剪碎而来,倘若脂肪移植后的早期血运重建方式是以单纯的血管吻接而完成,则整块脂肪移植组远期移植效率应该优于颗粒脂肪移植组。另外,本课题组的前期实验还发现在脂肪移植后的两周内,脂肪移植物内的血管内皮细胞几乎完全死亡。由此可见脂肪移植物内的血管内皮细胞也不可能参与血管新生的过程。因此,脂肪移植后组织块内血运的重建主要是由宿主血管的新生而来。基于颗粒脂肪移植后期的主要组织来源是宿主,且在第4W组织学变化显著,所以我们针对c组第4W的组织行全组织染色标记,发现组织块内可见大量hoechst+/GFP+/CD34+的细胞,组织块是将C57小鼠的脂肪充分游离后移植至GFP小鼠背部,这部细胞呈现出GFP+则说明这部分细胞主要来源于宿主,CD34+细胞则说明这部分由宿主而来的细胞具有分化潜能。同时对其血管周的细胞行免疫组化染色,标记细胞核增殖抗原Ki67,发现这部分细胞呈现Ki67阳性,说明这部分由宿主来源的且具备增殖活性的CD34+细胞是移植物内组织新生主要细胞来源。此外,我们还发现这部分细胞能够部分的参与新生血管的构建。结论1、脂肪移植后期组织块内部组织来源主要为宿主,在脂肪移植后第8W,颗粒脂肪移植组宿主来源占70%,移植物来源占15%；整块脂肪移植组宿主来源占25%,移植物来源占20%。2、颗粒脂肪移植后的血管片段不能以血管吻接的方式参与血运重建,而且其中的内皮细胞在移植后两周几乎完全死亡,颗粒脂肪移植后的血运重建主要是由宿主来源的新生血管长入而成。3、移植物内的组织新生的细胞学基础主要为来源于宿主的CD34+细胞,这部分具有增殖活性,同时也能够部分地参与新生血管的形成。