论文部分内容阅读
查尔酮合酶(Chalcone Synthase,CHS)是类黄酮合成途径中的一个关键酶。CHS表达量的增加或减少都可能导致植物叶色的变异。本研究利用RAPD技术,筛选出与李属(Prunus)植物红叶性状相连锁的分子标记;并采用同源克隆的方法,克隆5种李属植物查尔酮合酶基因的cDNA序列。主要研究结果如下:1.以红叶李(P. salicina×P. atropurupurea)和安哥诺李(Prunus salicina cv.‘angenuo’)为杂交组合,正反交后得到56株F1代杂交苗。结合分离群体分组分析法(Bulked Segregate Analysis, BSA),依据F1代杂交苗叶片颜色划分出“红叶”和“绿叶”两个分离群体,构建“红叶”和“绿叶”两个近等基因池。应用RAPD标记技术,用随机引物对两个基因池、父母本及其余F1代个体DNA进行PCR扩增,筛选与李属植物叶片红色性状相连锁的分子标记。研究结果显示,通过对350个随机引物的筛选,获得一个在红叶基因池中能稳定扩增而在绿叶基因池中不出现的RAPD标记,该扩增条带大小约为2 300 bp,命名为S450-2 300。经过重复性验证和F1代群体单株验证,该标记片段仅在红叶个体(重组型除去)中出现,表明与李属植物叶片红色性状相连锁,连锁距离为11.2 cM。2.以红叶李、安哥诺李、黑杆樱李(Prunus wrasifers‘Nigra’)、美人梅(Prunus×bliriana‘Meirenmei’)和紫叶李(Prunus cerasifera var. atropurpurea)为试材,采集不同时期的叶片,用试剂盒法提取总RNA。以Oligo(dT)为引物,在反转录酶作用下合成cDNA第一链,并用设计的特异引物CHS-F和CHS-R进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳检测显示,5种李属植物各扩增出一条大约1 200 bp的条带,与预期的条带大小一致。用试剂盒将目的基因片段回收后与载体pGEM-T连接,转化大肠杆菌感受态细胞DH5α。用上述特异引物对单菌落进行PCR扩增,结果表明多数为阳性克隆菌落。将检测为阳性克隆的菌落送测序公司测序,测序结果显示,所得到的5种李属植物的CHS基因cDNA序列长度为1 170 bp~1 176 bp,推测的氨基酸序列长度为389~391个氨基酸。CHS基因cDNA序列同源性分析表明,5种李属植物的CHS基因之间同源性非常高,均在95%以上,其中美人梅与紫叶李之间更是高达99.3%。将序列在Genbank中Blastn,结果发现5种李属植物与己报道的CHS序列的同源性也达到80%以上,证明成功分离到了5种李属植物CHS基因的cDNA序列。