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目的:毒死蜱(O,O-diethyl O-3,5,6-trichloro-2-pyridyl phosphorothioate,CPF)是一种广泛使用的杀虫剂,人体长期低水平暴露会产生不良效应,特别是孕期暴露对胎儿和出生后儿童发育的不良影响已广受关注。流行病学研究发现,孕期暴露CPF可能增加婴儿和儿童急性白血病发病的风险。在胎儿发育早期,肝脏是主要的造血器官,其细胞组成以CD34+造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSC)为主。因此,外源化合物宫内暴露对CD34+HSC的DNA损伤很可能是出生后血液疾病的病理基础,通常涉及11q23的混合谱系白血病(Mixed Lineage Leukemia,MLL)基因重组。MLL基因重组是婴儿急性白血病主要病理特征,可能与Topoisomerase II(Topo II)抑制及/或氧化应激诱导的DNA氧化损伤和细胞早期凋亡有关。本研究旨在:(1)评价CPF诱导的CD34+HSC细胞毒性和DNA双链断裂和MLL基因重组;(2)进一步探讨Topo IIα、β亚基在CPF诱导的Topo II-DNA可切割复合物中的作用;(3)筛选CPF暴露CD34+HSC引起的全基因组差异表达基因及探讨其可能的病理生理意义。方法:(1)建立人胚胎肝脏CD34+HSC的CPF暴露体系;(2)应用Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测CPF暴露后HSC的活力,乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)释放反应检测CPF对HSC的细胞毒性;(3)利用中性彗星实验检测CPF暴露后CD34+HSC的DNA断裂情况;(4)应用Topo II-DNA可切割复合物(The trapped in agarose DNA immunostaining,TARDIS)实验检测CPF暴露后Topo II-DNA可切割复合物的形成情况;(5)利用荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)技术采用DNA双色探针检测CD34+HSC中MLL基因重组发生情况;(6)采用Gene Chip?Human Genome U133 Plus 2.0 Array全基因谱芯片检测CPF诱导的HSC差异基因表达;(7)利用实时荧光定量PCR技术验证HSC差异表达基因。结果:(1)人胚肝CD34+HSC来自孕龄18-24周流产胚胎肝脏。利用人CD34+磁珠分选试剂盒对初提CD34+HSC进行分选提纯,以CD34-FITC标记后用BD FACS流式细胞仪进行提取后验证,提取效率接近100%,提取纯度均在95%以上;(2)通过对LDH的释放进行检测,暴露于1、5、10、25、50和100μM CPF浓度的CD34+HSC的细胞存活率分别为84.48%,58.62%,35.63%,35.63%,12.07%和8.62%,暴露于1μM VP-16阳性对照的CD34+HSC细胞存活率为58.62%,表明CPF 1μM时对CD34+HSC造成显著影响。利用CCK-8对72 h内的细胞抑制率进行检测。结果显示随着CPF浓度剂量的增加,细胞的增殖抑制率呈现浓度依赖性上升;(3)中性彗星实验中,1、10和50μM的CPF或10μM的VP-16暴露增加了CD34+HSC的DNA双链断裂的发生,并且呈剂量依赖反应关系,非遗传毒性化合物的特异性阴性对照在测试范围(即细胞毒性水平)不能诱导DNA双链断裂。(4)TARDIS实验显示,0、10和50μM的CPF或10、50μM的VP-16于CD34+HSC中作用下,细胞体内形成的Topo IIα裂解复合物呈剂量依赖性。0、10μM的CPF作用和10、50μM的VP-16作用下在细胞体内形成的Topo IIβ裂解复合物呈剂量依赖性。(5)FISH实验显示,1和10μM的CPF暴露能够诱导CD34+HSC MLL基因重组,比例分别为0.5%和3%,呈剂量依赖性增加。HSC暴露于1μM VP-16,FISH检测显示MLL基因重组。(6)全基因谱芯片检测CPF 1、10μM和阳性对照VP-16 1μM对HSC差异基因表达的影响,结果显示1μM CPF引起1个基因上调和15个基因下调;10μM CPF引起17个基因上调和62个基因下调,且下调基因涵盖1μM CPF组的13个下调基因(THBD、CCL2、G0S2、TNIP3、CCL8、PHLDA2、IL7R、TFPI2、IL6、IL1B、CCL7、IL1A以及CXCL5),并呈剂量-反应关系;而1μM VP-16引起21个基因上调和14个基因下调,且与CPF的差异基因没有任何重叠。(7)荧光定量PCR对部分表达差异性高的基因进行验证,包括3个CPF低、高剂量组共同下调基因(G0S2、TNIP3、PHLDA2),2个上调基因CPF 10μM组(CEACAM6、CDKN1C),VP-16 1μM组2个上调基因(CDKN1A、MDM2)和3个下调基因(E2F8、HELLS、CCNE2)。其中G0S2、TNIP3和PHLDA2表达量趋势与基因芯片结果一致,一定程度地证明了基因芯片数据可信性。其他基因目前仍在验证中,虽然经过调整引物设计、PCR条件控制等,但诸多方面需进一步完善。结论:(1)CPF可能诱导HSC DNA-Topo IIα-CPF和DNA-Topo IIβ-CPF可裂解复合物的形成,而抑制HSC Topo II活性,从而导致DNA双链断裂和MLL基因重组;(2)CPF和VP-16可能通过不同的途径诱导HSC细胞毒性、DNA损伤、Topo II抑制和MLL基因重组。