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第一部分,目的:比较不同的兔VX2肝癌模型的建立方法,探讨股动脉插管技术的应用,为该模型的应用提供实验依据。
材料与方法:将24只实验兔随机分成3组,每组8只,分别用瘤细胞悬液直视下注射法、直视下瘤块注入后用明胶海绵封堵穿刺通道法及直视下瘤块注入后局部压迫法建立兔VX2肝癌模型,比较不同方法的成瘤结果,并对荷瘤兔进行影像学及组织病理学评价。对实验兔进行股动脉置鞘后的介入操作,探讨经股动脉插管的可行性。
结果:24只实验兔中死亡2只,存活兔经剖腹探查证实肝脏肿瘤种植成功20只(成功率90.9%,20/22);三组成瘤率分别为71.4%(5/7)、100%(7/7)、100%(8/8),前者成瘤多为多结节、分叶状,腹腔及全身转移多见,与后两者均有统计学差异,后两者成瘤多为孤立病灶且成瘤速度快,后两者成瘤状况无统计学差异,腹腔及远处转移少见。成瘤后的影像学及组织病理学亦证实前述结果。CT平扫肿瘤多呈等或低密度区,坏死部分呈更低密度,增强扫描动脉期表现为边缘环状强化;MRI示肿瘤实质部分T<,1> WI呈低信号,T<,2>WI呈稍高信号;DWI呈明显高信号,境界清晰;坏死部分呈长T<,1>、长T<,2>信号。VX2肝癌的影像表现与其病理学变化具有很好的一致性。所有实验兔处死前均经股动脉直视下Seldinger法置入4F导管鞘后引入导管行血管造影获成功者20例(成功率90.9%,20/22)。
结论:直视下注入瘤块后局部压迫法操作简便、成瘤率高,所成肿瘤多为孤立病灶,转移少见,更适合建立兔VX2肝癌模型的实验要求。CT、MRI可很好地反映肿瘤生长及坏死等病理学变化,有利于荷瘤兔的监测和筛选。经股动脉置鞘后行介入操作方法可行,尤其适用于复杂的介入操作。
第二部分,目的:以兔VX2肝癌模型为对象,探讨经导管动脉内注入脂质体介导的p53基因治疗肝癌的可行性及基因的转染和表达情况。
材料与方法:取影像学显示成瘤直径3cm左右的兔VX2肝癌模型15只,随机分成3组,分别将pCMV-myc-p53质粒、阳离子脂质体LipofectAMINE以及pCMV-myc-p53和LipofeetAMINE的复合体注入上述3组兔VX2肝癌模型的肿瘤供血动脉内,48小时后处死实验兔,提取肿瘤组织蛋白,用Western Blot及免疫组化法检测基因的转染及其表达情况;另取影像学显示成瘤直径3cm左右的兔VX2肝癌模型18只,随机分成6组,分别将0μg、7.5μg、10μg、15μg、20“gμ和30μg的p53基因与相应量的LipofectAMINE形成的复合体分别注入兔VX2肝癌模型的肿瘤供血动脉内,同法检测基因的转染及其表达情况。
结果:脂质体介导的p53基因经动脉途径成功转染了兔VX2肝癌模型的肿瘤组织并在肿瘤组织内进行表达,其转染效率明显高于单纯基因导入组,在一定范围内,转染效率与导入基因的量正相关。
结论:经动脉途径导入脂质体介导的p53基因治疗肝癌是可行且有效的,具有广阔的应用前景。
第三部分,目的:探讨经导管动脉内联合应用转铁蛋白对脂质体介导的p53基因治疗肝癌的转染效率及治疗效果的影响。
材料与方法:取影像学显示成瘤直径3cm左右的兔VX2肝癌模型24只,随机分6组,分别将pCMV-myc-p53质粒、阳离子脂质体LipofectAMINE、转铁蛋白(Tf)、pCMV-myc-p53和LipofectAMINE的复合体、pCMV-myc-p53和LipofectAMINE及Tf的复合物注入上述6组兔VX2肝癌模型的肿瘤供血动脉内,48小时后处死实验兔,提取肿瘤组织蛋白,用Western Blot、免疫组化及免疫荧光检测基因的转染及其表达情况。取影像学显示成瘤直径3cm左右的兔VX2肝癌模型15只,随机分成5组,分别将0μg、100μg、200μg、300μg、400μg Tf与相应量的LipofectAMINE和pCMV-myc-p53形成的复合体混合后分别注入兔VX2肝癌模型的肿瘤供血动脉内,同法检测基因的转染及其表达。取影像学显示成瘤直径3cm左右的兔VX2肝癌模型24只,随机分成6组,分别将pCMV-myc-p53质粒、阳离子脂质体LipofectAMINE、转铁蛋白(Tf)、pCMV-myc-p53和LipofectAMINE的复合体、pCMV-myc-p5 3和LipofectAMINE及Tf的复合物注入上述6组兔VX2肝癌模型的肿瘤供血动脉内,对各组实验兔的肝肾功能进行术前、术后比较,对肿瘤体积进行影像学比较并观察其生存时间。
结果:联合应用Tf及脂质体介导的p53基因经动脉途径成功转染了兔VX2肝癌模型的肿瘤组织并进行表达,其转染效率明显高于无Tf组,在一定范围内,转染效率与Tf的量呈正相关。应用Tf及脂质体对实验兔肝肾功能无影响,应用Tf组实验兔肿瘤体积明显小于同期无Tf组,其生存期亦长于后者。
结论:经动脉途径联合应用转铁蛋白可明显提高脂质体介导的p53基因的转染效率,可提高p53基因的治疗效果且是安全的,在肝癌的基因治疗上有广阔的应用前景。