论文部分内容阅读
背景原发性醛固酮增多症(primary aldosteronism, PA)是临床上常见的疾病,其特点是大量醛固酮激素自主分泌进而引发多系统症状,具有多器官受累的特征。PA可由不同原因引起,其治疗方法也各不相同。醛固酮瘤(aldosterone producing adenoma, APA)和特发性醛固酮增多症(idiopathic hyperaldosteronism, IHA)是原发性醛固酮增多症的常见病因,尤其是前者更为多见,在治疗上针对不同的病因需采取不同的治疗方法：前者手术治愈率达90%以上,而后者需药物治疗。尽管人们在PA的病理病因及预防治疗上取得了很大的进展,但PA的详细发病机制仍然不是很清楚。类固醇生成因子-1(steroidogenic factor-1, SF-1)是类固醇激素合成的重要转录因子,所有类固醇激素合成酶启动子区域均具有SF-1结合位点,它不仅参与类固醇激素的合成和调控,而且对肾上腺发育和性腺分化也发挥重要作用。醛固酮激素的合成是由其限速酶醛固酮合成酶(CYP11B2)来实现的,不仅如此,血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AT-Ⅱ)是醛固酮合成的最主要调节因素。关于SF-1在醛固酮激素分泌及PA致病中的研究报道不多,且结论不统。近年来,人们对CYP11B2及醛固酮瘤进行了广泛的研究,但多数报道集中在病例报告及组织水平的个别指标检测上,缺乏细胞水平的深入研究。为此,本文从组织水平和细胞水平对SF-1进行了研究,通过改变SF-1基因表达水平,进一步探讨其在PA发病中的作用。方法1.分别收集16例醛固酮瘤组织标本和12例正常肾上腺组织标本,醛固酮瘤经临床检验和病理诊断所确诊,正常肾上腺标本来源于肾上腺无受累的肾癌或肾盂癌根治术,用Western blot法检测各标本SF-1蛋白表达水平，荧光定量PCR法检测其mRNA表达水平2.根据GenBank数据库提供的SF-1基因核苷酸序列,设计3条能转录短发卡RNA (small hairpin RNA, shRNA)的DNA序列,与pGenesill质粒载体连接,并通过后续检测筛选出干扰效果最强的1条,构建靶向抑制人SF-1基因的shRNA真核表达载体,命名为pGenesill-SF-1-shRNA,转染H295R细胞,通过Western blot和荧光定量PCR法验证其对SF-1基因表达的抑制效果。3.用pGenesill-SF-1-shRNA转染H295R细胞作为实验组细胞,通过荧光定量PCR及放射免疫法测定其CYP11B2 mRNA水平及醛固酮激素分泌水平,与对照组H295R细胞进行对比,判断SF-1在其中的作用。应用AT-Ⅱ刺激H295R细胞,分析刺激后不同时间段CYP11B2 mRNA的表达水平,进而求得最大值及对应时间点。相同的方法处理实验组H295R细胞,通过对比AT-Ⅱ刺激各组细胞后CYP11B2和醛固酮激素的增幅水平,判断SF-1基因沉默在上述过程中的作用。4.WST-1法及细胞计数法检测转染后两组细胞的增殖情况,用免疫组化SABC法检测转染后各细胞组中Ki-67的表达,TUNEL法检测细胞的凋亡情况,进而了解SF-1对肾上腺皮质癌H295R细胞的影响。结果1.醛固酮瘤组SF-1无论在蛋白表达水平还是在]mRNA表达水平均高于正常肾上腺组,蛋白表达水平分别为(0.87±0.05和0.39±0.07, P<0.01), mRNA水平则前者是后者的10.48倍(P<0.01),差异均具有统计学意义。2.经酶切和DNA测序鉴定,成功构建了靶向抑制人SF-1基因的shRNA真核表达载体pGenesill-SF-1- shRNA,转染H295R细胞后应用Western blot和荧光定量PCR法验证,SF-1在蛋白水平和mRNA水平分别下降了69.07%和71.2%(P<0.01),符合实验要求。3.相对于对照组H295R细胞,SF-1基因沉默组细胞的CYP11B2 mRNA表达水平升高7.6倍,醛固酮激素分泌水平是前者的2.04倍。AT-Ⅱ刺激后12h时CYP11B2mRNA表达水平最高,与未刺激前相比,实验组和对照组的CYP11B2 mRNA增幅分别是50.21倍和800.09倍(P<0.001),后者是前者的15.93倍(P<0.001)。同样,AT-Ⅱ刺激后醛固酮激素分泌水平均升高,对照组细胞刺激前后分别为(0.061±0.007) ng/ml和(0.256±0.014) ng/ml (P<0.01);而实验组醛固酮激素在AT-Ⅱ刺激前后则分别为(0.101±0.010) ng/ml和(0.252±0.016) ng/ml (P<0.01),两组相比,前者增幅高于后者1.7倍(P<0.01)。4.通过连续4天的检测,实验组细胞和阴性对照组细胞增殖水平都在上升,但二者的增殖程度不一致。WST-1及细胞计数法均显示SF-1基因沉默组细胞增殖缓慢,增殖明显受到抑制,SF-1抑制组和对照组细胞数约为(4.50±0.25)及(6.25±0.29)×103个(P<0.01)；而TUNEL结果恰好相反,荧光镜下SF-1基因沉默组凋亡细胞的数目及形态均比较明显,凋亡细胞数约为阴性对照组的3.7倍(P<0.01)；免疫组化显示SF-1基因干扰后,其Ki-67阳性细胞率要低于阴性对照组细胞,分别为(16.9±2.17)%和(33.48±±3.16)%(P<0.01)。结论1.SF-1在APA中表达升高,这种表达上调可能在PA的发病中发挥着重要作用,有望成为深入研究PA发病机制的分子指标。2.在基础状态下,SF-1对CYP11B2表达和醛固酮合成起负调节作用。在AT-Ⅱ刺激后,SF-1基因沉默可以降低CYP11B2及醛固酮对AT-Ⅱ刺激的敏感性。3.抑制SF-1基因表达可以明显影响人肾上腺皮质癌H295R细胞增殖,促进其凋亡,有望成为研究肾上腺肿瘤发病机制及其治疗的重要分子。