盐地碱蓬SsNCED1基因的克隆及其功能研究

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脱落酸(ABA)是一种植物激素,它在调节植物的生长、发育、种子的休眠以及植物对逆境胁迫的适应中起到重要的作用,因此调节高等植物ABA的生物合成对于植物来说具有重要的意义。在高等植物ABA的生物合成中,生化与遗传研究表明,9-顺式-环氧类胡萝卜素二加氧酶(NCED)催化的反应被证明是关键步骤,它催化的底物来自于玉米黄素环氧化酶(ZEP)催化产生的环氧类胡萝卜素,裂解生产ABA的前体物黄质醛,黄质醛经进一步的氧化生成ABA。 拟南芥基因组中有9个编码NCED的基因(表1),按催化裂解位点可分为两类,一类催化9顺式类胡萝卜素在C11和C12位置的裂解的NCED(如拟南芥的AtNCED3),产生ABA的前体物黄质醛;另一类是催化类胡萝卜素在C9和C10或C9’和C10’双键的氧化断裂(如拟南芥的AtNCED1),它所产生的产物并不是ABA的前体物质。本实验从400mM处理真盐生植物盐地碱蓬(Suaeda salsa)地上部分构建的cDNA文库中随机测序得到的1000个ESTs中得到了两个编码NCED,根据已测的序列设计引物以cDNA文库为模板进行PCR扩增,得到了全长的cDNA序列,全长为全长为1,972 bp,5’和3’UTR区长度分别为72 bp和229 bp,编码566氨基酸残基,分子量约为62.5 KDa。Blastx和进化树分析发现它与拟南芥AtNCED1在氨基酸水平上的一致性高达77%,这说明SsNCED1属于NCED基因家族中的第二类基因。Northern杂交分析发现,盐和甘露醇处理可以诱导SsNCED1在根和地上部分中的表达,高温也诱导该基因在地上部分和根中的表达,这表明SsNCED1是个与逆境相关的基因。Southern杂交分析表明,SsNCED1在盐地碱蓬的基因组中存在多个拷贝。 为了进一步确定SsNCED1的功能,我们用过量表达策略将SsNCED1导入拟南芥,PCR和Southern杂交分析该基因已整合到拟南芥基因组中,Northern杂交分析表明除盐地碱蓬SsNCEDI基1tl的克隆及其功能研究9一23株系表达不明显外,其它株系均可正常地表达。通过对转基因株系的生理分析发现,过量表达SsNCED]并没有增加拟南芥对盐、千旱等胁迫的耐受性,也没有延迟转基因植株种子的萌发,酶联免疫法测定ABA的含量发现导入的Ss入℃百D了没有改变转基因植株的幼苗的和种子中的ABA含量,这说明该基因在植物的耐逆和ABA的生物合成中并不起作用,但是转基因植株的类胡萝卜素的含量比野生型拟南芥的低,这可能是由于它所催化的反应与AtNCEDI类似,其催化产物并不是ABA的前体物质,该基因编码的蛋白只是在类胡萝卜素的代谢中起作用。令我们无法解释的一个现象是过量表达SsNCEDI增加了转基因植株对外源ABA的敏感性。 在的GeneBal业库中,与拟南芥AtNCEDI同源的基因注册的数目越来越多,目前己有13个,并且有些基因是从地上组织构建的cDNA文库中克隆得到的(如鳄梨的尸aJVCEL〕2)。尽管我们还不清楚它们的功能,但它在植物体内的作用可能是很重要的。它在植物生长发育过程中的作用机制我们还不清楚。
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