草莓镶脉病毒运动蛋白功能域分析及其胞内运动机制研究

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植物病毒侵入寄主,先在细胞内大量复制,经过胞内、胞间的横向运输和维管束长距离径向运输,才能成功系统侵染寄主。这个过程涉及病毒自身特异性编码的运动蛋白(movement protein,MP)。研究表明,草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)编码的P1蛋白是一个运动蛋白,但是病毒进入寄主体内如何进行胞内、胞间和长距离运动机制尚不明确。本课题分析和鉴定了MP蛋白的功能域,并研究了SVBV MP蛋白的胞内运动机制,为进一步研究SVBV MP蛋白的功能奠定了基础。1.SVBV MP蛋白功能域的预测利用软件分析了SVBV MP蛋白的功能域,发现119 aa-233 aa为运动相关的关键区域,而30 aa-55 aa和283 aa-329aa是蛋白互作的关键区域。2.SVBV MP蛋白运动相关功能域的鉴定为了确定MP蛋白的功能域,构建了3个缺失突变体pCV-MP?30-55-YFP、pCV-MP?119-233-YFP、pCV-MP?283-329-YFP。(1)MP缺失突变体的亚细胞定位含pCV-MP-YFP、pCV-MP?30-55-YFP、pCV-MP?119-233-YFP、pCV-MP?283-329-YFP和pCV-YFP的农杆菌浸润本氏烟,发现MP及其突变体MP?30-55和MP?283-329均能够定位在细胞壁上,而突变体MP?119-233定位在细胞质和细胞核上。说明MP蛋白119 aa-233 aa区域是决定MP运动相关的功能域。(2)MP缺失突变体的运动回补功能含p PVX-?P25-GFP、p PVX-?P25-GFP+p Bin438、p PVX-?P25-GFP+p Bin-MP?30-55、p PVX-?P25-GFP+p Bin-MP?119-233和p PVX-?P25-GFP+p Bin-MP?283-329的农杆菌浸润本氏烟,发现MP、MP?30-55和MP?283-329能够互补运动缺陷型PVX载体,绿色荧光能从单个细胞向外扩散至3-4个细胞乃至整个叶片。表明MP蛋白119 aa-233 aa是决定MP运动相关的功能域。3.SVBV MP蛋白与P4蛋白互作相关功能域的鉴定(1)酵母双杂交验证互作功能域质粒p GBK-MP?30-55+p GAD-P4、p GBK-P4+p GAD-MP?30-55、p GBK-MP?119-233+p GAD-P4、p GBK-P4+p GADMP?119-233、p GBK-MP?283-329+p GAD-P4和p GBK-P4+p GAD-MP?283-329分别共转化酵母,发现p GBK-P4+p GAD-MP?119-233共转化的酵母细胞能够在选择培养基上生长。表明MP 30 aa-55 aa和283 aa-329 aa是与P4蛋白互作的关键功能域。(2)双分子荧光互补验证互作功能域含pCV-nYFP-MP?30-55+pCV-c YFP-P4、pCV-nYFP-P4+pCV-c YFP-MP?30-55、pCV-nYFP-MP?119-233+pCV-c YFP-P4、pCV-nYFP-P4+pCV-c YFP-MP?119-233、pCV-nYFP-MP?283-329+pCV-c YFP-P4和pCV-nYFP-P4+pCV-c YFP-MP?283-329的农杆菌分别共浸润本氏烟,发现浸润pCV-nYFP-MP?119-233+pCV-c YFP-P4农杆菌的本氏烟表皮细胞中出现黄色荧光,说明SVBV MP 30 aa-55 aa和283 aa-329 aa是与P4蛋白互作的关键功能域。4.SVBV MP蛋白的胞内定位含质粒pCV-MP-YFP的农杆菌浸润本氏烟,发现MP蛋白形成的点颗状物存在于细胞壁和细胞质中,而且MP形成的点颗状物在细胞质中能够沿着某种轨迹移动,最终定位于胞间连丝(PD)。表明MP蛋白形成的点颗状物在细胞质中沿着某种轨迹靶向PD。5.SVBV MP蛋白与微管的共定位含质粒pCV-MP-YFP和pCV-MT-RFP的农杆菌共浸润本氏烟,发现MP蛋白能够和微管(MT)共定位。用微管抑制剂处理本氏烟表皮细胞后,再浸润含质粒pCV-MP-YFP和pCV-MP-YFP+MT-RFP的农杆菌,发现MP蛋白任然能够和微管(MT)共定位,只是靶向胞间连丝(PD)的MP蛋白数量明显减少。表明SVBV MP蛋白靶向PD与细胞骨架微管的结构有关,但是微管不是MP蛋白胞内运输的唯一途径。6.SVBV MP蛋白与微丝的共定位含质粒pCV-MP-YFP和p CAM-ABD2-GFP的农杆菌共浸润本氏烟,发现MP蛋白能够和微丝(ABD2)共定位,说明SVBV MP蛋白靶向PD与细胞骨架微丝有关。7.SVBV MP蛋白与内质网的共定位含质粒pCV-MP-YFP和pCV-ER-RFP的农杆菌浸润本氏烟,发现MP蛋白能够和内质网(ER)共定位,说明SVBV MP蛋白靶向PD与内质网有关。8.SVBV编码蛋白间的互作质粒p GBK-P3+p GAD-P4和p GBK-P4+p GAD-P3分别共转化酵母,发现SVBV P3与P4蛋白互作。含pCV-nYFP-P2+pCV-c YFP-P3、pCV-nYFP-P3+pCVc YFP-P2、pCV-nYFP-P3+pCV-c YFP-P4和pCV-nYFP-P4+pCV-c YFP-P3的农杆菌共浸润本氏烟,发现P2和P3以及P3和P4能够互作。说明SVBV包裹核酸形成的病毒粒子的CP蛋白(P4)能够与P3蛋白互作,在蚜传蛋白(P2)与P3作用下将病毒粒子带入寄主体内,然后病毒粒子在MP-P4作用下,沿着细胞骨架和内质网在胞内运动。
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