在中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)的创伤性脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)和脑卒中以后,损伤的轴突很难再生。外部环境和神经元的内在特性都是CNS轴突再生失败的原因[1],内因是成熟的神经元已经失去了再生潜能,外因为损伤后局部微环境不利于轴突的生长,外源性的抑制轴突的因子有髓鞘相关抑制分子,胶质瘢痕,炎症等[2]。决定轴突再生的内源性因子有随年龄变化的基因,转录因子,细胞骨架调节因子,线粒体等[3]。通过中和外源性的抑制分子如NOGO,髓鞘相关抑制蛋白(Myelin-associated Glycoprotein,MAG),软骨素酶ABC(Chondroitinase ABC),免疫调节等改善轴突生长的外部坏境;用基因相关的技术调节如雷帕霉素靶蛋白(The Mammalian Target of Rapamycin,mTOR),信号转导和转录激活因子3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3,STAT3),Kruppel样因子(Kruppel-like Factors,KLFs),b-Raf激酶(Raf Kinase,b-Raf)和SOX11等信号通路,联合脑源性神经营养因子(Brain-derived Neurotrophic Factor,BDNF),睫状神经生长因子(Ciliary Neurotrophic Factor,CNTF),胰岛素样生长因子1(Insulin-like Growth Factor 1,IGF1),能很好的促进CNS轴突再生,但能应用于临床的治疗方法极少。骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)最初在骨基质中发现,是一个可溶性的蛋白,后来研究发现它可以作为一个细胞因子广泛存在于各个器官,能够和细胞表面的整合素(Integrins)以及CD44结合,向细胞内传递信号,激活激酶级联反应和转录因子,促进细胞的粘附,运动和生存[4]。我们前期的研究发现,联合应用OPN/IGF1/CNTF,能够促进视神经损伤后的轴突再生[5,6];腹腔注射增加轴突传导速率的钾离子通道阻断剂4-氨基吡啶(4-Aiminopyridine,4-AP)和它的衍生物4-氨基吡啶-3-甲醇(4-Aiminopyridine-3-Methanol,4-AP-3-MeOH),能够促使损伤动物的视觉敏感度明显提高[5]。但是在SCI和脑卒中模型中,OPN/IGF1是否能够促进轴突再生,进而促进动物运动功能恢复还未可知。程序性死亡1(Programed Death-1,PD-1)是一个I型跨膜蛋白,由一个IgV样的胞外段,一个跨膜区域和胞内段组成。PD-1的胞内段分两部分,免疫受体酪氨酸相关的抑制性基序(Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibitory Motif,ITSM)和免疫受体酪氨酸相关的转化基序(Immunoreceptor Tyrosine-based Switch Motif,ITSM)[7]。PD-1属于CD28家族成员之一[8]。它的受体(PD-L1/PD-L2)广泛表达在T细胞,B细胞,自然杀伤性T细胞(Natural Killer T cell,NKT),巨噬细胞和树突状细胞(Dendritic Cells,DC)等[9,10]。在T细胞中,PD-1通过和它的受体相互作用,能够抑制细胞增殖和细胞因子的分泌[11,12]。在B细胞中,PD-1能够抑制B细胞的激活,扩增和抗体合成[13]。用PD-1敲除的小鼠研究发现,PD-1是免疫反应的负性调节分子,在中枢和外周耐受中都发挥重要作用[10,14]。脑卒中以后小胶质/巨噬细胞表达PD-1,和野生小鼠相比,PD-1敲除的小鼠梗死体积变大[15]。我们前期的研究发现,SCI后,和野生小鼠相比,PD-1敲除的小鼠运动功能恢复差,体内、外实验都显示PD-1敲除以后促进巨噬细胞向M1型极化。在本实验中的动物模型中,我们建立两种模型,锥体束半切模型(Pyramidotomy,PY)和光化学栓塞脑卒中模型,在损伤的对侧皮层注射AAV-mcherry和AAV-OPN/IGF1或者AAV-PLAP,每隔一周进行行为学检测、录像,行为学检测方法有糖丸取回(Single-pallet Retrieval),胶带移除(Sticker Remove),吃意面(Pasta Handling),不规律水平步行梯(Irregular Ladder Walking)等。损伤后13周腹腔注射4-AP-3-MeOH,检测相关行为学变化。接着消除OPN/IGF1小鼠部分发芽的神经元后,继续进行相关的行为学检测。最后在损伤20周动物灌注取材,进行免疫组化染色,分析未损伤轴突向对侧发芽的情况。体外实验,通过培养小胶质/巨噬细胞,给予脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和γ干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)刺激后,流式检测PD-1及其受体PD-L1/PD-L2的表达情况。接着分别培养野生小鼠,PD-1敲除小鼠,PD-1高表达小鼠和PD-L1敲除小鼠来源的巨噬细胞,给予LPS和IFN-γ刺激不同时间,用Western Blot,分子克隆,药物阻断等方法,研究分析PD-1调节巨噬细胞极化的分子机制。在PY模型中,行为学恢复方面,实验组和对照组没有明显区别;但皮层注射AAV-OPN/IGF1的颈段脊髓轴突代偿性的发芽明显多于AAV-PLAP组。直径4mm的光化学栓塞模型中,Sticker remove表现为自发性恢复;Single-pallet retrieval几乎没有恢复;在损伤后的第十周,实验组Irregular ladder walking恢复好于对照组,有统计学差异。脊髓未损伤侧轴突向对侧发芽情况与PY类似。接着我们做了直径为2.5mm的光化学栓塞模型,同样在损伤对侧皮层注射AAV-OPN/IGF1或者AAV-PLAP,进行行为学分析发现,在损伤后第八周实验组Food retrieval和Irregular ladder walking的恢复情况明显好于对照组。小鼠腹腔注射4-AP-3-MeOH以后,AAV-PLAP组行为学无变化,而AAV-OPN/IGF1的小鼠运动行为学有了更好的恢复。实验组和对照组在损伤的体积方面没有差异,但是在皮层,皮层下的各个层面及脊髓颈段和腰段,AAV-OPN/IGF1组的轴突发芽数量和标记轴突的荧光强度都多于AAV-PLAP组。消除OPN/IGF1组小鼠发芽至损伤侧的神经元后,OPN/IGF1引起的Single-pallet retrieval和Irregular ladder walking的行为学恢复也消失;解剖学分析颈段和腰段发芽的轴突数量也相应的减少。体外培养腹腔来源的巨噬细胞,巨噬细胞系Raw264.7,骨髓干细胞诱导的巨噬细胞和新生鼠皮层小胶质细胞发现,在LPS+IFN-γ的作用下,小胶质/巨噬细胞能够表达PD-1及其受体PD-L1,但不表达PD-L2;在LPS+IFN-γ作用不同时间后,和野生型巨噬细胞相比,PD-1和PD-L1敲除的巨噬细胞,诱导型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase,i NOS)表达增高,流式检测肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor alpha,TNF-α)阳性的细胞比例也增高,高表达PD-1的巨噬细胞表达iNOS降低;敲除PD-1和敲除PD-L1的巨噬细胞,Stat1,p-Stat1和p-NF-κB表达升高,蛋白激酶B(Protein Kinase B,PKB/Akt)/mTOR信号通路激活增加,高表达PD-1以后,Stat1和NF-κB蛋白表达并没有低于野生型,但mTOR下核糖体蛋白S6激酶(Ribosomal Protein S6 Kinase,S6K)活性明显降低。野生型和PD-1敲除的腹腔巨噬细胞,在给予LPS+IFN-γ的同时用不同浓度的雷帕霉素阻断mTOR,发现敲除PD-1的巨噬细胞iNOS表达明显低于WT巨噬细胞,说明PD-1敲除可能通过Akt/mTOR信号通路促进巨噬细胞向M1型极化。通过以上实验,说明应用OPN/IGF1能够促进CNS损伤后皮质脊髓束(The Corticospinal Tract,CST)的发芽,进而促进动物运动功能的恢复;敲除PD-1以后,可能通过激活Akt/mTOR信号通路促进巨噬细胞向M1型极化。我们的研究为以后临床应用OPN/IGF1促进轴突再生和了解PD-1调节巨噬细胞极化的分子机制提供了实验依据。