泥鳅TCRγ和TCRδ基因的克隆及表达模式

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泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)是水产养殖的重要经济物种,广泛分布于中国、日本和其他东南亚国家。近些年市场对于泥鳅的需求越来越大,价格上涨,各地养殖泥鳅的积极性也在高涨,但随着泥鳅养殖规模的扩大,高放养密度和不断恶化的水产养殖环境导致了不少常见的传染病,这给泥鳅养殖业造成了巨大的经济损失。T细胞受体(TCR),其不仅在识别病原体和激活下游免疫相关途径中起着重要作用,其在免疫系统中也起着至关重要的作用。迄今为止,对泥鳅病原性感染后γδTCR基因所发挥的免疫功能知之甚少。在本研究中,我们首先克隆并鉴定了泥鳅脾脏的TCRγ、TCRδ链的全长cDNA,然后研究了泥鳅中的TCRγ、TCRδ在早期胚胎阶段和不同组织中的表达情况。我们构建了柱状黄杆菌(F.columnare G4)、小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)和水霉(Saprolegnia sp.)在泥鳅中的感染模型,还初步评估了感染后泥鳅的鳃和皮肤的形态变化。此外,还在细菌、寄生虫和真菌感染后检测Ma-TCRγ、Ma-TCRδ的表达水平并以此构建了基因表达热图。主要实验内容及结果如下:1.利用实验室已经获得的泥鳅转录组数据库比对分析,经过PCR验证,发现泥鳅中存在T细胞受体(TCR)的两条链,分别为TCRγ和δ链,并通过RACE-PCR克隆出这两条链的全长cDNA序列。Ma-TCRγ和Ma-TCRδ的cDNA开放阅读框(ORF)长度分别是948 bp和867 bp,分别编码316和288个氨基酸。结构分析显示,它们具有信号肽,连接肽(connecting peptide,CPS),跨膜区(transmembrane,TM)和胞质区(cytoplasmic,CYT)以及两个免疫球蛋白区(immunoglobulin,Ig),与其他硬骨鱼类的TCR结构类似。T细胞受体的系统进化树显示,泥鳅T细胞受体与鲤科鱼类的T细胞受体有较近的亲缘关系。通过qRT-PCR的方法检测了TCRγ和δ两条链mRNA在肝脏、脾脏、肾脏、皮肤、鳃、肠道、眼、大脑、血液、肌肉、鳍条、脂肪和性腺中的表达情况。我们发现Ma-TCRγ主要在肾脏中表达量最高,其次是脾脏、鳃、鳍条和脑,Ma-TCRδ在鳃中检测到最高表达水平,而在肌肉中观察到最低表达水平。2.在我们的研究中,用柱状黄杆菌(1×105 CFU/ml)、小瓜虫(比例为10000Ich/尾的)及水霉孢子(浓度为1×105 zoospore/ml)浸泡感染泥鳅,研究发现泥鳅在受到柱状黄杆菌浸泡感染以后,其皮肤和鳃有明显的病理变化。与对照组相比,观察到泥鳅的次级鳃丝的长宽比明显变小,在皮肤表皮层中的杯状细胞与对照组相比明显增多。3.此外,构建了细菌(F.columnare G4)、寄生虫(Ichthyophthirius multifiliis)和真菌(Saprolegnia sp.)等三种泥鳅感染模型。通过qRT-PCR检测感染后Ma-TCRγ、Ma-TCRδ的表达情况,并评估了感染柱状黄杆菌和小瓜虫前后皮肤和鳃的形态变化,结果清楚地表明:Ma-TCRγ和Ma-TCRδ的mRNA高表达水平不仅仅在皮肤和鳃中出现,在肾脏和脾脏中同样也出现高表达,并且这些高表达与感染源密切相关,与柱状黄杆菌感染相比,在受到小瓜虫和水霉感染时Ma-TCRγ和Ma-TCRδ的mRNA表达水平相对较高,感染后在经典免疫器官(肾脏和脾脏)中有更高的表达量。我们的研究结果首次提示,对不同病原体的感染,泥鳅的TCRγ和TCRδ可能具有不同的功能。本研究不仅为T细胞受体的进化研究提供了信息,而且有助于说明在泥鳅中TCRγ和TCRδ在受到不同水生病原体刺激后所发挥的免疫应答作用。
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