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鲫造血器官坏死症,又名鲫疱疹病毒病,是一种由鲤疱疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）引起的高度传染性水生动物病毒性疾病（Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2）。鲫造血器官坏死症流行范围广,传播速度快,致死率高,严重威胁鲫养殖产业的健康发展。目前,围绕该病致病机理与防治方法方面的研究越来越受到关注。本研究:1)比较了13株不同地区来源CyHV-2分离株的部分基因序列,包括ORF25、ORF25B、ORF25D、ORF55和ORF72;2)分析了CyHV-2 ORF25基因序列的抗原表位、疏水区及亲水区位点,利用原核表达系统对CyHV-2 ORF25编码蛋白富含抗原表位的区域进行截短表达,制备了抗CyHV-2 ORF25编码蛋白的多克隆抗体,通过间接免疫荧光和免疫保护力测定等实验研究了表达蛋白的免疫原性;3)利用毕赤酵母表达系统表达了CyHV-2 ORF25截短基因编码蛋白,并通过病毒复制抑制、胶体金免疫电镜、血清中和试验、免疫保护力测定等实验研究了表达蛋白的免疫原性;4)采用酵母双杂交系统初步筛选出CyHV-2 ORF25编码蛋白与异育银鲫脑组织细胞（Gibel carp brain,GiCB）相互作用的细胞受体。具体研究内容和结果如下:1.13株不同地区来源CyHV-2部分基因序列的比较分析对13株不同地区来源CyHV-2分离株的ORF25、ORF25B、ORF25D、ORF55和ORF72基因序列比较分析发现,13株CyHV-2分离株的ORF25和ORF72基因序列保守性好,与中国参考毒株SY-C1（GenBank Access.No.KM200722.1）和日本参考株ST-J1（GenBank Access.No.NC019495.1）的ORF25和ORF72基因序列一致。13株CyHV-2 ORF55基因序列与中国参考毒株SY-C1 ORF55基因序列一致,与日本参考株ST-J1 ORF55基因序列相比较缺失9个碱基。13株CyHV-2 ORF25B和ORF25D基因序列与中国参考株SY-C1 ORF25B和ORF25D基因序列存在差异。2.原核表达CyHV-2 ORF25截短基因编码蛋白诱导的免疫应答利用生物信息学技术综合分析CyHV-2 ORF25编码蛋白的抗原表位、疏水区及亲水区位点,选取富含抗原表位的区域进行原核表达,表达的重组蛋白tORF25（truncated proteins ORF25,tORF25）分子量约为28 kDa,与预期大小一致。将重组蛋白tORF25纯化后免疫日本大耳兔,制备了多克隆抗体,Western blot检测显示该抗体能特异性识别重组蛋白tORF25。间接免疫荧光实验结果表明,该多克隆抗体可与感染了CyHV-2的GiCB细胞发生特异性的结合。攻毒实验结果显示,免疫了重组蛋白tORF25鲫的相对存活率为48%。3.酵母表达CyHV-2 ORF25截短基因编码蛋白及特性研究以原核表达的ORF25蛋白编码序列为模板,设计特异性引物进行PCR扩增,将扩增产物克隆到酵母表达载体pPICZαB后,转化至酵母菌株KM71中进行表达。表达产物重组蛋白y-tORF25（truncated proteins ORF25 expressed in yeast,y-tORF25）纯化后与GiCB细胞孵育,通过免疫胶体金技术观察到重组蛋白y-tORF25可特异性吸附于GiCB细胞表面。将重组蛋白y-tORF25与GiCB细胞孵育后再感染CyHV-2,病毒滴度(TCID50)测定结果为104.1/mL,与对照组相比病毒滴度显著降低。4.酵母表达CyHV-2 ORF25截短基因编码蛋白诱导的免疫应答将重组蛋白y-tORF25以20μg/尾剂量经背部肌肉注射免疫健康鲫,免疫后鱼体的白细胞介素11基因（IL-11）和补体C3基因表达量明显增加,IL-11在免疫后第4d达到峰值,补体C3基因在第7 d达到峰值。免疫重组蛋白y-tORF25后,鲫抗CyHV-2中和抗体滴度最高可达1:327。攻毒感染实验结果显示,免疫重组蛋白y-tORF25鲫的相对存活率为75%,表明毕赤酵母表达的重组蛋白y-tORF25有较好的免疫原性。5.GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库的构建提取GiCB细胞RNA,构建了GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库。将构建好的文库质粒转化大肠杆菌DH5α,其滴度为1.93×106 CFU/mL。阳性菌株PCR结果显示,插入片段的大小在1.5 kb左右。将文库从大肠杆菌中提取后,转化酵母菌Y187,转化效率为1.03×106 CFU/μg,滴度为1.24×106 CFU/mL,表明建立的GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库可用于CyHV-2与GiCB细胞相互作用的研究。6.CyHV-2 ORF25编码蛋白诱饵载体的构建及鉴定以CyHV-2 ORF25基因序列为模板设计特异性引物并扩增,将PCR产物克隆到酵母表达载体pGBKT7上,构建重组质粒,命名为pGBKT7-ORF25。将重组质粒转化至酵母菌Y2H Gold,阳性重组菌株命名为pGBKT7-ORF25/Y2H Gold,挑取重组菌株进行自激活性和毒性检测,结果显示重组菌株在SD/-Trp平板和SD/-Trp/X-ɑ-Gal平板上能培养出白色菌落,未见蓝色菌落,而在SD/-Leu和SD/-Trp/Aba+/X-ɑ-Gal平板上未能培养出菌落。表明重组菌株不能自激活报告基因,且对酵母菌Y2H Gold无毒性,可用于酵母双杂交实验。7.GiCB细胞与CyHV-2 ORF25编码蛋白相互作用的蛋白受体初步筛选融合培养重组菌株pGBKT7-ORF25/Y2H Gold和GiCB细胞酵母双杂交cDNA文库菌。将融合产物经筛选培养基反复筛选,最终得到1株开放阅读框正确的阳性菌株,ORF长度为618 bp。在GenBank数据库中对该序列进行同源性分析发现,其编码的蛋白为蛋白激酶C1受体（Receptor of activated protein kinase C1,RACK1）。提取融合的阳性菌株中质粒,转化至酵母菌Y187后,将转化后酵母菌Y187中只含有RACK1质粒的菌株与重组菌株pGBKT7-ORF25/Y2H Gold再次融合培养。结果显示,两菌株可以特异性结合,初步验证了ORF25编码蛋白可与RACK1受体的结合。综上所述,本研究比较分析了CyHV-2部分基因的序列差异,查明CyHV-2ORF25编码蛋白具有较好的免疫原性,初步筛选到CyHV-2 ORF25编码蛋白的GiCB细胞受体,研究结果不仅为深入研究CyHV-2的致病机理奠定了基础,同时也为抗CyHV-2药物和新型疫苗的研发奠定了重要理论依据。