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本研究将禽流感病毒H5HA基因与不同启动子融合得到重组基因,用农杆菌介导的方法将它们转入马铃薯栽培品种Desiree中,并对其在马铃薯体内的表达情况进行分析;此外,本研究构建了马铃薯淀粉分支酶SBEⅠ基因和SBEⅡ单基因以及双基因的RNA干扰载体,并将其转入马铃薯Desiree体内,对马铃薯内源SBEⅠ和SBEⅡ基因表达进行抑制,通过检测转基因淀粉中直链淀粉含量,对马铃薯内源SBE基因表达的抑制情况进行分析。研究结果如下:1.将编码禽流感病毒H5N1亚型的血凝素基因H5HA的cDNA片段分别与马铃薯淀粉粒结合型淀粉合酶Ⅰ(GBSS Ⅰ)和甘薯贮藏蛋白A(SpoA)基因的启动子序列融合后,插入植物表达载体pBIN19,得到pBIN19/Gp-H5HA和pBIN19/Sp-H5HA质粒载体。通过农杆菌介导法分别将重组基因转入马铃薯体内,经NPT Ⅱ抗性筛选得到了 Gp-H5HA和Sp-H5HA两个转化系列。分别用PCR、Western印迹杂交和Western斑点杂交方法对H5HA重组基因在马铃薯体内的表达情况进行了分析,并将分析结果与35Sp-H5HA(H5HA基因片段与CaMV35S启动子融合)转基因系列进行了比较。研究结果表明,三个重组的H5HA基因在马铃薯薯块中均获得了表达,其表达量最高的是融合GBSS Ⅰ启动子的H5HA重组基因,最低的是融合SpoA启动子的H5HA的重组基因。2.以马铃薯支链淀粉合成中的关键酶SBE和SBEⅡ基因的编码序列为靶标,应用RNA Structure 3.2软件中的Oligo Walk工具,寻找出与RNA靶标紧密杂交的寡聚体,构建SBEⅠ和SBEⅡ单基因以及SBEⅠ-SBEⅡ双基因的RNA干扰双元表达质粒载体:pBIN20/SBEⅠ F-R,pBIN20/SBEⅡ F-R 和 pBIN20/SBEⅡ/Ⅰ F-SBEⅠ/Ⅱ R。采用农杆菌介导法将重组基因转化马铃薯后,得到三个转化系列。分别对转基因马铃薯淀粉粒形态、表观直链淀粉含量、凝胶化特性等理化性质进行分析。结果表明,利用RNA干扰技术单独抑制SBEⅠ或SBEⅡ基因的表达,不能提高直链淀粉含量,甚至会导致含量降低。而在SBEⅠ和SBEⅡ表达同时抑制的转基因系列中,超过50%的株系直链淀粉含量高于对照。其中,Ri-SBEⅠ+Ⅱ-53株系表观直链淀粉的含量(49.1%)与对照相比(28.5%)提高了 20.6%;该转基因淀粉糊化起始温度、峰值温度与对照相比差异不大,但热焓值变化很大,由对照的700.86J/g降低到210.95J/g。此外,淀粉粒形态观察的结果表明,SBE的RNA干扰基因在马铃薯薯块中表达,对淀粉粒的形态有影响。淀粉粒经碘染色后,在显微镜下可以观察到淀粉表面或内部的裂纹,其明显程度与直链淀粉的含量有关。