1研究背景：胃癌已经成为全世界第四大常见的恶性肿瘤和第二大癌症相关死亡原因。虽然传统的组织病理学分类可以较好地预测胃癌的治疗结果和预后,但具有相同病理组织类型的患者常由于个体差异而具有不同的预后,这可能是归因于遗传异质性的差异。广泛根治性切除术是局限期胃癌的标准治疗方式。然而,术后复发仍然是治疗失败的主要原因。不同的胃癌患者对治疗的反应不同,目前还没有已知明确的生物学标志物可准确预测胃癌辅助化疗的疗效。氟尿嘧啶类和奥沙利铂联合方案被广泛的用于胃癌的辅助化疗,但是至今也没有可靠的分子标志物能准确预测氟尿嘧啶类(氟尿嘧啶注射液或卡培他滨)和奥沙利铂组合(FP-LOHP)在胃癌辅助化疗中的疗效。肝癌缺失基因.-1 (deleted in liver cancer 1, DLC1)作为GTP酶激活蛋白(G TPase activated protein, GAP)在肿瘤中发挥抑制肿瘤活性。起初,D LC1是在肝细胞癌中发现下调,其下调在肝细胞癌中的发生率约50%。此后,研究陆续报道了DLC1 mRNA在诸如淋巴瘤、结直肠癌和胃癌等多种恶性肿瘤中下调。研究表明,沉默DLC1可促进细胞增殖和迁移,而恢复DLC1的表达能抑制细胞迁移、增殖等恶性生物学行为。虽然DLC1基因的下调在胃癌细胞系中已被证实,但DLC1蛋白在胃癌中的表达状态及其预后意义仍不明确,尤其是其在胃癌辅助化疗中的作用仍未知。另一方面,DLC1的下调和尿路上皮癌、口腔鳞状细胞癌、肺癌、皮肤黑色素瘤、卵巢癌的不良预后关系密切。此外,有研究表明DLC1的低表达与依托泊苷、卡铂在肺癌中的化疗敏感性有关。因此我们推测,胃癌中DLC1的表达状态可能通过影响某些化疗药物的疗效而影响预后。基于当前的研究结果,我们推测DLC1在胃癌中的低表达与其不良预后有关。此外,我们还尝试着就DLC1是否会影响某些化疗药物的疗效进行探索。因此,我们用免疫组化染色方法检测了DLC1蛋白在胃癌和相应的正常粘膜样本中的表达水平,并分析了胃癌中DLC1蛋白表达水平与临床病理特征、生存、复发及辅助化疗疗效的关系。2.材料和方法2.1病人随访所有纳入研究的患者都于2000-2011年在南方医科大学南方医院(中国广州)行组织病理学检查,并被确诊为胃癌。所有患者都根据AJCC癌症分期手册(第7版,2010)分期标准进行分期。我们还随访了各个患者的术后复发时间(time to relapse,TTR)和／或总生存时间(overall survival,OS), TTR为手术切除到复发(磁共振成像或CT检查发现)的时间段,OS则为手术到胃癌相关死亡的时间段,因其他原因死亡的情况则定义为删失。所有数据均源自医院病历系统记录或电话随访。共收集288对胃癌样本和相应的癌旁组织。用福尔马林固定所有样品,并进行石蜡包埋。2.2免疫组化染色评分两个未接触过患者临床病理资料的病理学专家对DLC1蛋白的免疫组化染色结果进行评分。免疫组化染色的总分等于染色面积和染色强度得分的乘积。于10倍镜的视野下进行观察并评分,基于每100个肿瘤细胞中阳性染色细胞的平均百分比计算染色面积,染色面积评分具体标准如下：0分(0%-10%),1分(11%-25%),2分(26%-50%),3分(51%-75%),和4分(大于75%)。染色强度具体评分标准如下：0分(阴性),1分(弱黄色),2分(黄色或深黄)和3分(褐色或深褐色)。所有患者根据染色总分分为两组：DLCl蛋白低表达组(总分0-5)和DLC1蛋白高表达组(总分6-12)。2.3统计分析我们用统计软件SPSS19.0对结果进行分析。用卡方检验评估DLC1蛋白表达与临床病理指标的相关性。采用one-way ANOVA或Student’s t-test检验对DLC1蛋白免疫组化染色总分进行分析比较。用Kaplan-Meier法作生存曲线,并采用对数秩检验(log-rank)检测生存曲线之间的差异。用Cox比例风险回归进行单因素和多因素的分析以研究死亡和复发的危险因素。本研究中所有P值都为双向,且P<0.05表示有统计学意义。3研究结果3.1患者临床病理特征及治疗情况总结我们对288例患者的总生存时间(OS)进行了随访(IB-III期251例,IV期37例)。其中,251例IB-III期患者行D2胃大部切除术,术后接受了辅助化疗,但均未接受过放化疗或术前化疗。此外,对所有IB-III期患者还进行了至复发时间(TTR)的随访。在接受过辅助化疗的患者中,有104例接受了奥沙利铂联合氟尿嘧啶类(FP-LOHP)辅助化疗,而其他147例则接受了不包含FP-LOHP的化疗方案治疗。所有患者年龄均处于25～85岁不等(中位年龄52岁)。随访时间为0.5～79.0月不等(中位随访时间为26.3月)。3.2 I)LCl蛋白在胃癌和周围正常胃黏膜组织中的考我们用免疫组织化学染色方法检测了所有石蜡包埋胃癌样品和相应癌旁正常组织中DLC1蛋白的表达状态。结果显示,DLC1蛋白主要表达于细胞质中,且大多数胃癌样品中DLC1蛋白的免疫组化染色评分低于相应的癌旁组织[73.61%(212/288对)](P<0.001)。DLC1蛋白低表达在胃癌组织样本中的发生率[75.69%(218/288对)]较正常黏膜高[21.18%(61/288)](P<0.001)。3.3 DLC1蛋白表达水平与胃癌临床病理特征的关系为了进一步探索DLC1蛋白在胃癌进展过程中的作用,我们分析了DLC1蛋白表达水平与患者临床病理指标之间的关系。卡方检验结果显示,DLC1蛋白表达高低与胃癌的TMN分期(P<0.001)、淋巴结转移状况(N)(P<0.001)、肿瘤浸润深度(T)(P=0.004)、肿瘤大小(P<0.001)和远处转移情况(P=0.040)有关。但是DLC1蛋白表达水平与如下病理特征无明显关系：肿瘤的分化程度(P=0.098),年龄(P=0.814)及性别(P=0.260)。同时,DLC1蛋白在胃癌中表达的总体水平显著低于相对应的正常黏膜组织(P<0.001)。此外,TNM分期较晚(P<0.001)、淋巴结转移较多(P<0.001)、浸润深度较深(P<0.001)、肿瘤体积较大(P<0.001)以及远处转移率较高(P<0.001)的胃癌组织样本中DLC1蛋白染色评分往往较低。然而,不同分化程度的肿瘤之间免疫组化染色评分没有统计学差异(P=0.116)。这些结果提示,DLC1蛋白表达水平在胃癌进展过程中降低。此外,我们还对胃癌中DLC1蛋白表达水平与某些化疗疗效之间的关系进行了研究。3.4胃癌中DLCl蛋白水平与预后的关系我们进行了单因素和多因素回归分析以探索胃癌中DLC1蛋白的预后意义。单因素分析结果显示,肿瘤大小(P<0.001)、肿瘤分化程度(P<0.001)、TNM分期(P<0.001)、肿瘤侵袭深度(T)(P<0.001)、淋巴结转移情况(N)(P<0.001)和DLC1蛋白表达水平(P<0.001)均与胃癌术后复发有关。且肿瘤大小(P<0.001)、肿瘤分化程度(P<0.001)、TNM分期(P<0.001)、肿瘤侵袭深度(T)(P<0.001)、淋巴结转移情况(N)(P<0.001)及DLC1蛋白表达水平(P<0.001)也与胃癌患者的生存相关。与此同时,对这些参数进行多变量分析,我们发现DLC1蛋白表达水平是复发(P=0.004)和生存(P=0.001)的独立危险因素。且DLC1蛋白低表达患者的复发(HR,2.232；95%CI,1.295-3.847)和死亡(HR,2.910；95%CI,1.543-5.488)风险是高表达者2倍以上。以上数据表明,通过免疫组化检测DLC1蛋白表达可以预测胃癌的复发和死亡风险。为进一步探索DLC1蛋白低表达对胃癌复发和总生存的影响,我们使用Kaplan-Meier生存分析法对至复发时间(TTR)和总生存时间(OS)进行分析。在251例IB-Ⅲ期患者中,DLC1蛋白低表达者比高表达者具有更短的TTR(3年无复发生存率分别为30.1%和73.4%)。另外,在288例IB-Ⅳ期患者中DLC1蛋白低表达患者相对于高表达者表现出更短的总生存时间(5年生存率率是21.2%和62.8%)。我们还分别分析了DLC1蛋白表达对IB-Ⅲ期患者(均接受根治性切除术)和Ⅳ期患者(均行姑息性手术)总生存时间的影响。结果表明,无论是IB-Ⅲ期还是IV期患者,DLC1低表达患者生存时间相对较短。其中IB-Ⅲ期DLC1低表达胃癌患者的中位TTR为26.0个月,而IB-Ⅳ期患者的中位OS为36.0个月。同时,在IB-Ⅲ期患者中超过半数的DLC1阳性患者至随访结束也未复发。3.5 DLCl蛋白表达水平与胃癌术后辅助化疗疗效的关系FP-LOHP被广泛的用于胃癌辅助化疗中。然而,不同患者对FP-LOHP反应差别很大,且目前没有可靠的生物标记物可准确预测该化疗组合的临床治疗效果。因此,我们迫切希望了解DLC1蛋白表达水平是否会影响FP-LOHP的临床治疗效果。在此,我们对251例接受过辅助化疗的IB-III期胃癌患者进行了分析。结果显示,在接受过FP-LOHP辅助化疗的DLC1蛋白高表达患者[DLC-1 (+)/FP-LOHP(+)]中,一半以上复发时间超过3年(89.6%),且总生存时间超过5年(69.0%)。因此中位无复发时间或中位总生存时间未给出。Kaplan-Meier分析结果显示,接受了FP-LOHP作为辅助化疗的胃癌患者复发率和死亡率比接受其他化疗方案者相对较低。但是,只有在DLC1蛋白高表达组中接受了FP-LOHP辅助化疗者[DLC1(+)/FP-LOHP(+)]相对于接受其他化疗方案者[DLC1(+)/FP-LOHP(-)]显示出更长的TTR和OS,而在DLC1低表达组中接受FP-LOHP方案化疗患者相对接受其他化疗方案患者无明显获益。4.研究结论(1).DLC1蛋白在胃癌中表达降低。(2).DLC1蛋白表达降低与胃癌进展有关,且预示着不良预后。(3).DLC1蛋白高表达胃癌患者可从氟尿嘧啶和奥沙利铂联合辅助化疗中获益。