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研究背景:MicroRNAs(miRNAs)是一类高度保守的小分子非编码RNA,通过与靶基因的3’UTR结合参与调节细胞的多种生物学行为。越来越多的研究报导,miRNAs在鼻咽癌的发展过程中发挥重要作用,参与鼻咽癌细胞的增殖、周期调控、凋亡、转移等。虽然miR-126-3p在肿瘤中研究已有较多的报道,但在鼻咽癌中,miR-126-3p的功能和分子机制尚未见报导。鼻咽癌是来源于鼻咽粘膜的一种恶性肿瘤,在东南亚和我国南方发生较为集中。目前认为,鼻咽癌的发生可能与EB病毒感染、环境因素、遗传易感性等因素相关。越来越多的研究表明,miRNA的异常表达在鼻咽癌发生发展中起重要作用。例如,EB病毒编码的microRNABART7-3p通过调控PTEN介导的信号通路促进鼻咽癌细胞转移和细胞间质转化[1]。miR-3188通过mTOR-pPI3K/AKT-c-JUN环路抑制鼻咽癌细胞的增殖12]等。研究目的:探讨miR-126-3p在鼻咽癌中异常表达及其发挥的生物学功能。研究内容和方法:1.荧光定量PCR检测miR-126-3p在鼻咽癌组织和细胞中的表达2.miR-126-3p对鼻咽癌细胞生物学功能的影响1)采用CCK8细胞增殖实验、平板克隆形成实验与裸鼠皮下成瘤实验检测miR-126-3p对鼻咽癌细胞增殖能力的影响;利用划痕愈伤实验、transwell小室实验验证miR-126-3p对鼻咽癌细胞转移和侵袭能力的影响,Western blot 检测下调 miR-126-3p 对 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 蛋白表达的影响来验证miR-126-3p是否能逆转鼻咽癌细胞上皮间质转化,以此来确定miR-126-3p在鼻咽癌细胞中的功能;2)为明确下调miR-126-3p抑制鼻咽癌细胞增殖、侵袭和转移的机制，Western blot检测下调miR-126-3对p-AKT、AKT蛋白表达的影响。3.miR-126-3p靶基因验证1)生物信息学软件预测PTPN9基因的3’UTR与miR-126-3p的种子区高度互补;2)转染miR-126-3p Inhibitor后,RT-PCR检测鼻咽癌细胞中PTPN9基因mRNA水平的变化;3)转染 miR-126-3p Inhibitor 后,Western blot 检测鼻咽癌细胞中 PTPN9 基因蛋白水平的变化;4)双荧光素酶报告基因验证miR-126-3p是否能直接靶向调控PTPN9基因。研究结果1.荧光定量PCR结果表明miR-126-3p在鼻咽癌组织和细胞中表达分别高于鼻咽炎性组织与鼻咽癌细胞;2.下调miR-126-3p抑制鼻咽癌细胞增殖、侵袭转移和上皮间质转化1)体外功能实验CCK8,平板克隆形成实验结果表明,在5-8F和HONE1细胞株中下调miR-126-3p的表达显著抑制了鼻咽癌细胞的增殖能力。2)裸鼠皮下成瘤实验表明转染miR-126-3p Inhibitor组鼻咽癌细胞的体内成瘤能力明显降低,并且与空载对照相比,ki67和PCNA的表达量也明显降低,这表明下调miR-126-3p在体内抑制肿瘤形成;3)划痕愈伤实验和Transwell小室实验证明了下调miR-126-3p的鼻咽癌细胞体外迁移和侵袭能力明显减弱;4)Western blot实验表明下调miR-126-3p的鼻咽癌细胞中E-cadherin的表达上调,而N-cadherin和Vimentin的表达下调;这表明下调miR-126-3p的表达可以逆转鼻咽癌细胞的上皮间质转化。3.机制研究表明在鼻咽癌细胞5-8F和HONE1中下调miR-126-3p的表达下调了 p-AKT的变化,而总AKT没有明显差异,这表明下调miR-126-3p可能通过失活PI3K/AKT信号通路来抑制鼻咽癌细胞的增殖、转移和细胞间质转化。4.miR-126-3p可以靶向调控PTPN9基因1)利用生物信息学软件TargetScan预测到PTPN9是miR-126-3p的一个靶基因;2)荧光定量PCR结果显示下调miR-126-3p的5-8F和HONE1细胞中PTPN9的表达上调;3)Western blot结果显示下调miR-126-3p的5-8F和HONEI细胞中PTPN9的表达上调;4)成功构建 pmirGLO/PTPN9 wt 3’UTR 质粒和 pmirGLO/PTPN9 mt 3’UTR 质粒,与 miR-126-3p mimics 共转染 293T 细胞,以 pmirGLO 空载质粒为对照,荧光素酶活性检测在转染后24h进行。结果表明,野生型质粒 pmirGLO/PTPN9 wt 3’UTR 与 miR-126-3p mimics 共转染后荧光素酶的活性显著降低;突变质粒pmirGLO/PTPN9 mt 3’UTR与miR-126-3p mimics共转染后,荧光素酶活性没有明显变化。以上结果表明,miR-126-3p 能特异性结合 PTPN9 3’UTR。结论:1.miR-126-3p在鼻咽癌组织和细胞中高表达;2.下调miR-126-3p通过失活PI3K/AKT信号通路抑制鼻咽癌细胞增殖、转移和细胞间质转化;3.miR-126-3p直接靶向调控PTPN9基因。