【摘 要】
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目的:构建蛋白激酶MLK3基因敲除小鼠模型,探讨MLK3基因缺失对小鼠心功能的影响;构建平滑肌细胞特异性敲除MLK3小鼠模型,为后续探讨血管平滑肌细胞中MLK3维持血管稳态的作用与机制提供基础。方法:1.利用HPA数据库检索MLK3在心脏组织是否有表达,利用GEO公共数据库分析MLK3在心衰患者心脏组织中的的表达变化;通过TAC手术构建野生型小鼠心衰模型,用Western blot法检测MLK3在
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.91939106,No.81770470,No.81930014）
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目的:构建蛋白激酶MLK3基因敲除小鼠模型,探讨MLK3基因缺失对小鼠心功能的影响;构建平滑肌细胞特异性敲除MLK3小鼠模型,为后续探讨血管平滑肌细胞中MLK3维持血管稳态的作用与机制提供基础。方法:1.利用HPA数据库检索MLK3在心脏组织是否有表达,利用GEO公共数据库分析MLK3在心衰患者心脏组织中的的表达变化;通过TAC手术构建野生型小鼠心衰模型,用Western blot法检测MLK3在心脏组织中的表达变化;2.利用CRISPR-Cas9技术构建MLK3敲除小鼠,收集鼠尾提取基因组DNA,通过PCR鉴定基因型;PCR产物Sanger测序验证MLK3敲除序列,收取心脏组织通过qRT-PCR检测MLK3 m RNA表达;通过Western blot检测MLK3蛋白表达;3.利用超声心动图检测MLK3敲除小鼠的心功能;4.收取MLK3敲除小鼠心脏组织,通过HE染色进行常规形态学评价;通过Masson染色检测心脏纤维化;通过WGA染色观察心肌细胞肥厚;5.基于Cre/loxp重组酶的条件性基因敲除策略,构建平滑肌细胞特异性敲除MLK3小鼠模型,提取鼠尾基因组DNA,PCR鉴定基因型;收取主动脉组织进行免疫荧光染色,检测平滑肌细胞MLK3的表达。结果:1.通过查询HPA数据库发现MLK3在心脏组织有表达。GEO数据库统计分析,发现与非心衰对照组患者相比,MLK3在缺血性心肌病（ICM）（P＜0.0001）和扩张性心肌病（DCM）（P＜0.0001）导致的心衰患者中的心脏组织中表达均显著升高。Western blot检测证实MLK3在TAC心衰模型小鼠的心脏组织中表达升高（P=0.0421）;2.PCR鉴定确认MLK3-/-小鼠的基因型;Sanger测序显示MLK3基因的序列敲除正确;qRT-PCR结果证实MLK3 m RNA表达降低（P=0.0316）;Western blot显示MLK3蛋白表达降低;证实MLK3敲除小鼠构建成功;3.超声心动图结果统计发现,与WT小鼠相比,7-8月龄的MLK3-/-小鼠左室射血分数（EF%）（P＜0.0001）和左室短轴缩短率（FS%）（P＜0.0001）降低;左室收缩末内径（LVID;s）（P＜0.0001）和左室舒张末内径（LVID;d）（P=0.0032）增加;收缩末期左室后壁（LVPW;s）和舒张末期左室后壁（LVPW;d）变化没有统计学差异;表明MLK3基因敲除导致小鼠左室收缩功能降低、左心室扩大;4.对7-8月龄的MLK3-/-小鼠用戊巴比妥实施安乐死,收取心脏、胫骨。经统计发现,与WT小鼠相比,MLK3-/-小鼠的心脏重量与体重比增加（P=0.0002）,心脏重量与胫骨长度之比增加（P=0.0025）。HE染色结果发现,MLK3-/-小鼠心脏体积增大;WGA染色结果,发现MLK3-/-小鼠心肌细胞横截面积增大;Masson染色结果发现,MLK3-/-小鼠心脏纤维化不明显（P=0.0038）;5.PCR鉴定基因型,鉴定结果发现Cre基因型为阳性,MLK3 LoxP基因型为纯合阳性,平滑肌细胞特异性敲除MLK3小鼠构建成功;免疫荧光共定位染色显示,野生型小鼠主动脉平滑肌细胞MLK3蛋白表达,而特异性敲除小鼠平滑肌细胞MLK3蛋白表达缺失。结论:1.MLK3敲除小鼠构建成功。2.MLK3基因敲除导致小鼠心肌细胞肥大,左室收缩功能下降。3.平滑肌细胞特异性敲除MLK3基因小鼠构建成功。
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