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光学活性醇是一种有价值且前景广阔的手性合成砌块,广泛应用于手性药物的生产。生物催化因其无与伦比的立体选择性和自身固有的优势,已成为一种手性醇的绿色合成方式。针对重要抗抑郁药物度洛西汀中间体(S)-(-)-N,N-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙胺(DHTP)的不对称合成,本课题从来源于不同微生物的多种羰基还原酶中,获得能够不对称还原3-(二甲氨基)-1-(2-噻吩基)-1-丙酮(DTP)合成(S)-DHTP的目标酶羰基还原酶CR2,构建了羰基还原酶CR2重组体系,优化了相关的条件;并以此为基础,通过酶耦联法构建了羰基还原酶CR2和葡萄糖脱氢酶GDH融合酶CR2-Linker-GDH,以融合酶CR2-Linker-GDH催化DTP的不对称还原,该融合酶重组体系能够将底物DTP的浓度从10 g·L-1提高到20 g·L-1,且(S)-DHTP的产率达到近56%;研究融合酶CR2-Linker-GDH催化不对称反应的过程,通过调控反应过程中pH和补料策略,可使产物产率进一步提高。具体内容包括以下三部分:(1)本课题以DTP为底物,从来源于多种微生物的20个羰基还原酶中获得能够将底物高选择性性不对称合成(S)-DHTP的羰基还原酶CR2和KRD,通过比较二者的催化性能,最终选取CR2作为本课题的研究对象,构建了CR2重组酶体系,并优化了相关的酶催化反应条件,发现该反应的最适初始反应pH为pH 8.0,最适反应温度为30°C,然后将多种醇类和糖类辅底物应用于不对称还原反应,发现葡萄糖的促进作用最为明显,然后将不同浓度的葡萄糖和NADP+应用于不对称还原反应,发现120 g·L-1葡萄糖起到最佳的促进效果,辅酶浓度在0.1 mmol·L-1其TTN仍能保持241,对酶促反应的过程进行考察发现反应4 h时产物产率达到最大。通过在催化体系中添加0.1 mmol·L-1 NADP+和120 g·L-1辅底物葡萄糖,在反应温度30°C、pH 8.0的条件下,反应4 h,CR2粗酶体系能够不对称还原10 g·L-1DTP合成高光学纯度(S)-(DHTP)(>99.9%e.e.),产率为61.70%。(2)羰基还原酶是NADPH依赖性酶,构建了用于辅酶再生的羰基还原酶CR2和葡萄糖脱氢酶GDH融合酶CR2-Linker-GDH,考察了其动力学性质,发现融合酶CR2-Linker-GDH对DTP和葡萄糖的亲和性相当。该融合酶CR2-Linker-GDH重组体系能够将底物DTP的耐受性从原来的10 g·L-1提高到20 g·L-1,优化不对称还原反应的相关条件,表明pH 8.4是该酶促反应最偏爱的初始反应pH,40°C为最优反应温度;对葡萄糖浓度和辅酶浓度的研究,表明40 g·L-1的葡萄糖、0.1 mmol·L-1的NADP+能够发挥最大的酶催化效果。向反应体系中加入0.1 mmol·L-1 NADP+和40 g·L-1辅底物葡萄糖,反应8 h,该不对称转化反应的产率可以达到55.66%,对映体过量大于99.9%,时空产率为1.39 g·L-1·h-1。(3)分析CR2粗酶体系和CR2-Linker-GDH粗酶体系不对称转化过程发现反应过程中反应体系的pH明显下降,研究融合酶CR2-Linker-GDH催化不同底物浓度的过程曲线发现该酶促反应存在底物抑制现象。针对pH显著下降的问题,通过pH自动控制加液机调控反应体系pH维持恒定,可使得该酶促反应的产率进一步提高;针对底物抑制问题,在酶促反应过程中采取分批补料策略,即每间隔2 h补料5 g·L-1的底物和10g·L-1的葡萄糖,分四次补加可使得底物抑制作用减弱;在100 mL反应体系中对反应过程实行pH和分批补料的整体调控,可使酶催化效率更进一步提高,产物产率可达71.86%,光学纯度大于99.9%。