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肿瘤坏死因子受体相关因子6(Tumor necrosis factor receptor related factor 6,TRAF6)是先天免疫系统研究的一个新热点,在已知的细胞信号通路中,它既是接头因子,受众多上游受体介导;也是RING结构式的E3泛素酶,参与泛素一蛋白修饰系统和TLRs受体介导的信号过程。因此TRAF6在机体中必然有着特殊的使命,但是目前在草鱼中有关TRAF6的分子机制研究还不是很完善。干扰素调节因子5(Interferon regulatory factor 5,IRF5)和 TRAF6 同样可以参与TLR介导的细胞信号通路,而且IRF5是TLR4信号通路中的一个核心枢纽和关键因子,能够有效激活和调节IFN的转录调控,促进细胞的免疫系统活性以抑制肿瘤恶化。IRF5在细胞内处于低活性状态,转入细胞核及调控干扰素表达前是需要被活化的,但是在草鱼中TRAF6是否能活化IRF5以及活化的分子机制还不清楚。干扰素(Interferon,IFN)是宿主细胞应对病原体的损伤做出反应时释放的一组应激蛋白;它的表达由IRFs调节。如在脊椎动物的先天免疫中起着至关重要作用的IFN1可以被IRF5调节。但是在草鱼中LPS-IRF5-IFN信号通路的传导机制研究还有待深入。换而言之,目前在鱼类中,有关TRAF6调节IFN表达的分子机制尚不清楚。同样,TRAF6和IRF5之间的具体关系和作用的分子机制也是不确定的。在本文研究中,我们探索了草鱼(Ctenopharyngodon idella)TRAF6如何通过激活IRF5引发先天免疫。我们发现CiTRAF6,CiIRF5和CiIFN1在LPS刺激的CIK细胞中均显著上调,并且CiTRAF6的表达量上升在时间上要早于CiIRF5和CiIFN1的表达。这些发现表明,CiTRAF6、CiIRF5、CiIFN1在草鱼中承担着重要的功能,并且CiTRAF6可能在鱼类中诱导了 CiIFN1的表达。在单独过表达CiTRAF6或CiIRF5以及同时过表达CiTRAF6和CiIRF5实验中,结果显示CiIFN1表达水平以及CiIFN1启动子活性、CO细胞活力均显著上调,而且在共同过表达时达到最高,但在基因沉默实验中它们均显著下调。这表明CiTRAF6和/或CiIRF5调节了CiIFN1的表达,而这种调节并不依赖于外界病原体的刺激。定位分析发现正常情况下,CiTRAF6和CiIRF5都位于细胞质中。当进行LPS刺激24h后,我们观察到CiIRF5易位至细胞核中,这和我们通过蛋白核转位序列分析结果一致。说明了 CiTRAF6只存在于细胞质,并在细胞质中发挥功能;CiIRF5进入细胞核前必然出现状态的转变,如活化。GST pull down和Co-IP实验表明,CiTRAF6与CiIRF5相互作用。共定位分析还显示,CiTRAF6在细胞质中与CiIRF5结合,这暗示着CiTRAF6和CiIRF5之间存在某种相互作用。而且CiTRAF6的过表达增加了内源性CiIRF5表达,促进了其泛素化和核易位。综上所述,在细胞质中,CiTRAF6与的CiIRF5结合,然后激活CiIRF5,从而导致CiIRF5转入细胞核,促进下游的CiIFN1的表达水平上调。