论文部分内容阅读
DNA甲基化是最主要的表观遗传方式之一。生物体中基因表达、蛋白质相互作用以及肿瘤的产生发展等与DNA甲基化水平和DNA甲基化酶活性密切相关。发展简便、灵敏的甲基化酶检测新方法对于生化分析和临床相关疾病的诊断研究具有重要意义。本文基于恒温扩增技术,发展了两种简便、灵敏检测甲基化酶活性的新方法。具体内容如下:一、基于恒温指数扩增反应(EXPAR)检测甲基化酶活性。我们设计了无标记的发夹探针,该发夹探针的茎部有Dam甲基化酶的特异识别序列。当溶液中存在甲基化酶时,发夹探针被甲基化。然后加入限制性内切酶特异切割发夹探针,释放出来的环部序列可作为引物引发EXPAR反应。当无甲基化酶时,发夹探针未被切断,不能引发EXPAR反应。最后,EXPAR反应产物利用DNA特异荧光染料直接检测,实现了甲基化酶活性的测定。方法简便、快速、成本低,并可实现抑制甲基化酶活性的药物筛选,为抗癌药物的筛选提供了一种新方法。二、滚环扩增反应结合水溶性阳离子共轭聚合物均相检测甲基化酶活性的研究。我们新设计发夹探针,其在甲基化酶作用下,茎部的酶识别序列被甲基化。再经限制性内切酶切割后,释放的序列将作为引物引发滚环扩增反应(RCA)。在扩增过程中,我们加入荧光素修饰的dUTP(dUTP-FITC),它随扩增反应的进行而添加到DNA产物中。当加入PFP后,DNA与PFP通过静电力结合拉近荧光素与PFP之间的距离,并发生有效的荧光共振能量转移(FRET)。当无甲基化酶时,该发夹探针结构保持完整,不会引发RCA。溶液中游离的dUTP-FITC经碱性磷酸酶降解,降解产物与PFP相互作用很小,不能形成有效的FRET。基于FRET效率的不同,实现了甲基化酶活性的检测。该方法仪器简单、灵敏度高,检出限为0.36 U/mL。方法对于相关疾病的临床诊断及药物筛选具有潜在的应用价值。