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研究目的：
探索5-LOX通路在脑缺血炎性损伤中的作用，探讨黄芩苷(BC)与栀子苷(GP)及其7：3配伍(BC/GP)对氧糖剥夺/复氧小胶质细胞抑制5-LOX通路发挥神经保护作用机制。
方法：
(1)将pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro质粒载体转染293T细胞进行慢病毒包装，收集上清液，浓缩制成病毒颗粒，同样方法构建空载体病毒。病毒颗粒感染BV2小胶质细胞，G418进行细胞致死率筛选，挑选稳定转染的单克隆抗体细胞株。利用三期培养箱构建氧糖缺失/复氧模型，显微镜观察细胞形态。
(2)给予齐留通(Zileuton)，孟鲁司特(Montelukast)，U75302被用来分别阻断BV2细胞5-LOX过表达组与空载体对照组5-LOX，BLT1和CysLTR1通路。MTT与流式细胞仪分别检测5-LOX过表达组与空载体对照组BV2细胞活力与凋亡。免疫荧光观察5-LOX过表达组与空载体对照组BV2细胞NF-?B形态与荧光强度。RT-PCR检测5-LOX过表达组与空载体对照组BV2细胞5-LOX、FLAP、BLT1、BLT2、CysLTR1、CysLTR2、CD11b、LTA4h、LTC4的mRNA的表达。Westernblot检测5-LOX过表达组与空载体对照组BV2细胞5-LOX、FLAP、BLT1、BLT2、CysLTR1、CysLTR2、CD11b、LTA4h、CD206、NF-?Bp65、phospho-NF-?Bp65的表达。
(3)MTT检测不同浓度黄芩苷(BC)、栀子苷(GP)及其7﹕3配伍对5-LOX过表达的OGD/R的BV2细胞活力。ELISA检测BC、GP、BC/GP对5-LOX过表达OGD/R的BV2细胞TNF-α与IL-β炎性因子的影响。RT-PCR检测给予BC、GP、BC/GP治疗的5-LOX过表达OGD/R的BV2细胞中5-LOX、LTB4、CysLTs、CD11b、CD206的mRNA的表达。Westernblot检测给予BC、GP、BC/GP治疗的5-LOX过表达OGD/R的BV2细胞中5-LOX、FLAP、BLT1、BLT2、CysLTR1、CysLTR2、CD11b、LTA4h、CD206、NF-?Bp65、phospho-NF-?Bp65的表达。
结果
(1)病毒测序pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro/Alox5与Alox5序列一致。显微镜观察显示OGD分别0h、1h、2h、4h，复氧12h，OGD4h细胞后细胞形态改变，5-LOX过表达组细胞存活率降低。给予Zileuton、Montelukast、U75302可提高5-LOX过表达组BV2存活率。
(2)OGD/R造模BV2细胞后，BV2细胞活力下降(p＜0.01)，细胞凋亡增(p＜0.001)，免疫荧光NF-?B荧光增强，细胞核破裂增多，细胞形态发生改变。给予Zileuton、Montelukast、U75302组后，显示细胞形态恢复，荧光强度减弱。过表达5-LOX介导OGD/R损伤，与空载体空白组相比，过表达5-LOX细胞活力下降(p＜0.01)，细胞凋亡增加(p＜0.01)，给予Zileuton、Montelukast、U75302后可显著提高细胞活力(p＜0.01)，细胞凋亡减少(p＜0.01)。PCR结果显示，与空载体对照组相比，5-LOX过表达的BV2细胞中5-LOX、FLAP、BLT1、BLT2、CysLTR1、CysLTR2、CD11b、LTA4h、LTC4的mRNA的表达显著升高(p＜0.01)。Zileuton、Montelukast、U75302可显著抑制其mRNA的表达。Westernblot结果显示，与空载体对照组相比，5-LOX过表达的BV2细胞中5-LOX、FLAP、BLT1、BLT2、CysLTR1、CysLTR2、CD11b、LTA4h、CD206、NF-?Bp65、phospho-NF-?Bp65的蛋白表达显著升高(p＜0.01)。Zileuton、Montelukast、U75302可显著抑制蛋白的表达。
(3)BC、GP及其7﹕3配伍12.5浓度对BV2细胞生长无抑制(p＜0.01)。ELISA检测结果显示BC、GP、BC/GP可降低5-LOX过表达OGD/R的BV2细胞TNF-α与IL-β的表达(p＜0.01)。RT-PCR结果显示，与模型组相比，BC、GP、BC/GP治疗可降低5-LOX过表达OGD/R的BV2细胞5-LOX、LTB4、CysLTs、CD11b、CD206的mRNA的表达(p＜0.01)。Westernblot结果显示，与模型组相比，BC、GP、BC/GP治疗可降低5-LOX过表达OGD/R的BV2细胞5-LOX、FLAP、BLT1、BLT2、CysLTR1、CysLTR2、CD11b、LTA4h、CD206、NF-?Bp65、phospho-NF-?Bp65的表达(p＜0.01)。
结论
过表达的5-LOX可以介导小胶质细胞OGD/R的损伤和激活，其主要以LTB4/BLTs通路为主。GP、BC和BC/GP可以抑制5-LOX的表达，保护OGD/R下BV2细胞形态，细胞活力增加，细胞凋亡减少，炎性因子的表达降低。GP、BC、BC/GP的抑制炎性因子表达作用的发挥，通过抑制LTB4/BLTs和CysLTs/CysLTRs通路共同作用，且主要通过LTB4/BLTs通路。
探索5-LOX通路在脑缺血炎性损伤中的作用，探讨黄芩苷(BC)与栀子苷(GP)及其7：3配伍(BC/GP)对氧糖剥夺/复氧小胶质细胞抑制5-LOX通路发挥神经保护作用机制。
方法：
(1)将pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro质粒载体转染293T细胞进行慢病毒包装，收集上清液，浓缩制成病毒颗粒，同样方法构建空载体病毒。病毒颗粒感染BV2小胶质细胞，G418进行细胞致死率筛选，挑选稳定转染的单克隆抗体细胞株。利用三期培养箱构建氧糖缺失/复氧模型，显微镜观察细胞形态。
(2)给予齐留通(Zileuton)，孟鲁司特(Montelukast)，U75302被用来分别阻断BV2细胞5-LOX过表达组与空载体对照组5-LOX，BLT1和CysLTR1通路。MTT与流式细胞仪分别检测5-LOX过表达组与空载体对照组BV2细胞活力与凋亡。免疫荧光观察5-LOX过表达组与空载体对照组BV2细胞NF-?B形态与荧光强度。RT-PCR检测5-LOX过表达组与空载体对照组BV2细胞5-LOX、FLAP、BLT1、BLT2、CysLTR1、CysLTR2、CD11b、LTA4h、LTC4的mRNA的表达。Westernblot检测5-LOX过表达组与空载体对照组BV2细胞5-LOX、FLAP、BLT1、BLT2、CysLTR1、CysLTR2、CD11b、LTA4h、CD206、NF-?Bp65、phospho-NF-?Bp65的表达。
(3)MTT检测不同浓度黄芩苷(BC)、栀子苷(GP)及其7﹕3配伍对5-LOX过表达的OGD/R的BV2细胞活力。ELISA检测BC、GP、BC/GP对5-LOX过表达OGD/R的BV2细胞TNF-α与IL-β炎性因子的影响。RT-PCR检测给予BC、GP、BC/GP治疗的5-LOX过表达OGD/R的BV2细胞中5-LOX、LTB4、CysLTs、CD11b、CD206的mRNA的表达。Westernblot检测给予BC、GP、BC/GP治疗的5-LOX过表达OGD/R的BV2细胞中5-LOX、FLAP、BLT1、BLT2、CysLTR1、CysLTR2、CD11b、LTA4h、CD206、NF-?Bp65、phospho-NF-?Bp65的表达。
结果
(1)病毒测序pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-puro/Alox5与Alox5序列一致。显微镜观察显示OGD分别0h、1h、2h、4h，复氧12h，OGD4h细胞后细胞形态改变，5-LOX过表达组细胞存活率降低。给予Zileuton、Montelukast、U75302可提高5-LOX过表达组BV2存活率。
(2)OGD/R造模BV2细胞后，BV2细胞活力下降(p＜0.01)，细胞凋亡增(p＜0.001)，免疫荧光NF-?B荧光增强，细胞核破裂增多，细胞形态发生改变。给予Zileuton、Montelukast、U75302组后，显示细胞形态恢复，荧光强度减弱。过表达5-LOX介导OGD/R损伤，与空载体空白组相比，过表达5-LOX细胞活力下降(p＜0.01)，细胞凋亡增加(p＜0.01)，给予Zileuton、Montelukast、U75302后可显著提高细胞活力(p＜0.01)，细胞凋亡减少(p＜0.01)。PCR结果显示，与空载体对照组相比，5-LOX过表达的BV2细胞中5-LOX、FLAP、BLT1、BLT2、CysLTR1、CysLTR2、CD11b、LTA4h、LTC4的mRNA的表达显著升高(p＜0.01)。Zileuton、Montelukast、U75302可显著抑制其mRNA的表达。Westernblot结果显示，与空载体对照组相比，5-LOX过表达的BV2细胞中5-LOX、FLAP、BLT1、BLT2、CysLTR1、CysLTR2、CD11b、LTA4h、CD206、NF-?Bp65、phospho-NF-?Bp65的蛋白表达显著升高(p＜0.01)。Zileuton、Montelukast、U75302可显著抑制蛋白的表达。
(3)BC、GP及其7﹕3配伍12.5浓度对BV2细胞生长无抑制(p＜0.01)。ELISA检测结果显示BC、GP、BC/GP可降低5-LOX过表达OGD/R的BV2细胞TNF-α与IL-β的表达(p＜0.01)。RT-PCR结果显示，与模型组相比，BC、GP、BC/GP治疗可降低5-LOX过表达OGD/R的BV2细胞5-LOX、LTB4、CysLTs、CD11b、CD206的mRNA的表达(p＜0.01)。Westernblot结果显示，与模型组相比，BC、GP、BC/GP治疗可降低5-LOX过表达OGD/R的BV2细胞5-LOX、FLAP、BLT1、BLT2、CysLTR1、CysLTR2、CD11b、LTA4h、CD206、NF-?Bp65、phospho-NF-?Bp65的表达(p＜0.01)。
结论
过表达的5-LOX可以介导小胶质细胞OGD/R的损伤和激活，其主要以LTB4/BLTs通路为主。GP、BC和BC/GP可以抑制5-LOX的表达，保护OGD/R下BV2细胞形态，细胞活力增加，细胞凋亡减少，炎性因子的表达降低。GP、BC、BC/GP的抑制炎性因子表达作用的发挥，通过抑制LTB4/BLTs和CysLTs/CysLTRs通路共同作用，且主要通过LTB4/BLTs通路。