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微小RNA(microRNA)的发现是一个极其重要且突破性的发现,成熟的miRNA通过作用于mRNA,引发靶mRNA的降解或翻译抑制进而发挥其作用。目前在肿瘤的发生发展及相关转移的研究中发现miRNA在多种癌症中的表达失调发挥着重要的作用,包括结肠直肠癌(CRC)。在对miRNA众多探寻中不难发现,miRNA会调节Wnt信号通路,Wnt/β-catenin信号通路无论是在结直肠癌的增殖及转移中还是在其他恶性肿瘤中均扮演着极其重要的角色。研究发现miRNA能调节与其互补的靶基因从而调控Wnt/β-catenin通路进而参与像口腔鳞状细胞癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、食道癌等肿瘤的发生及转移。此外,在结直肠癌细胞中microRNA-145能靶向catenin delta-1调节Wnt/β-catenin信号通路发挥作用。本课题研究意义在于,我们在初始探究工作中用基因芯片筛选分析方法发现miR-24-1-5p和正常组织相比,在结直肠癌组织中差异表达。基于此前这项发现,将进一步研究明确miR-24-1-5p在结直肠癌组织和细胞中的具体表达情况,是如何调控的,并探索其对结直肠癌细胞系HCT-116和Caco2细胞生物学特征的影响作用,同时深层次理解miR-24-1-5p是如何发挥生物学功能的分子机理,为今后探求结直肠癌治疗方面找寻新的靶点奠定理论性的基础。研究结果:(1)组织miRNA基因芯片微阵列结果分析:鉴定异常表达的miRNA是在结肠直肠癌中阐明miRNA介导的致癌途径的第一步。基于这一点,我们采用基因芯片技术分析小鼠结直肠癌组织,对比miRNA图谱得出miR-24-1-5p在AOM+DSS组小鼠中低表达,但在BRB治疗12周后,其表达水平显著上调,提示miR-24-1-5p可能发挥肿瘤抑制作用,且BRB可作为肿瘤形成的化学预防剂。(2)MiR-24-1-5p在CRC组织和CRC细胞系中表达下调,用BRB处理的组织和CRC细胞系中表达上调:为了进一步评估来自基因芯片微阵列分析的结肠组织中的结果,通过RT-qPCR验证三组小鼠的结肠组织中及不同剂量BRB处理的5种人结肠直肠癌细胞系中的miR-24-1-5p表达。数据表明miR-24-1-5p的表达模式与基因芯片结果一致。(3)MiR-24-1-5p对结直肠癌细胞生物学行为的影响:为了进一步评估miR-24-1-5p的生物学功能,我们用RT-qPCR方法检测CRC细胞系(HCT-116和Caco2)转染效率,miR-24-1-5p的表达均明显升高。证明我们的转染成功,达到可进行下步实验的标准。MTT细胞增殖实验结果显示,在HCT-116和Caco2细胞中转染miR-24-1-5p质粒24小时后,miR-24-1-5p处理的细胞的存活率在HCT-116和Caco2细胞中分别为56%和52%,而对照细胞存活力是100%,这表明与对照细胞相比miR-24-1-5p可以显著降低CRC细胞的增殖率。细胞划痕实验结果显示,在miR-24-1-5p转染的细胞中观察到划痕距离明显增加,说明miR-24-1-5p能够显著的抑制细胞迁移作用。Transwell实验结果显示,miR-24-1-5p转染的细胞组中在荧光显微镜下能观察到的细胞数明显减少,由此证明miR-24-1-5p显著的抑制CRC侵袭。平板克隆实验结果显示,HCT-116-vector克隆形成数为386.3个,HCT-116–mi R-24-1-5p克隆形成数为130个,Caco2–vector克隆形成数为607.3个,Caco2–miR-24-1-5p克隆形成数为31个,说明miR-24-1-5p能抑制CRC细胞克隆形成率。(4)MiR-24-1-5p与β-catenin的3’-UTR可特异性结合,抑制其蛋白的表达:通过生物信息学软件miRanda v3.3a(评分S≥140和能量E≤-7.0)预测miR-24-1-5p可能结合的靶基因。从所有的候选靶基因中,我们选择β-catenin作为潜在的靶点,主要考虑到β-catenin蛋白在结肠直肠癌发展中发挥的重要作用;此外,β-catenin 3’-UTR中的miR-24-1-5p结合序列在物种间高度保守。通过RT-qPCR和Western Blot实验,检测miR-24-1-5p过表达对β-catenin的mRNA和蛋白质水平的影响。结果显示:过表达miR-24-1-5p不影响β-catenin mRNA水平,而是引起β-catenin蛋白表达水平显著降低。接下来,对β-catenin蛋白稳定性进行进行检测,分别用10μm CHX处理不同时间点(0,10,12,14小时)得出转染的miR-24-1-5p质粒组中β-catenin的蛋白质合成率显著降低,表明miR-24-1-5p能够抑制β-catenin蛋白的合成。这些结果表明,miR-24-1-5p通过直接结合β-catenin蛋白的3’-UTR而正向调节β-catenin蛋白的蛋白质合成。(5)MiR-24-1-5p抑制Wnt/β-catenin信号通路,抑制结直肠癌的发生:接下来通过使用RT-qPCR和Western Blot,在HCT-116和Caco2细胞中也研究了过表达的miR-24-1-5p对β-catenin蛋白的下游基因的影响,包括cyclinD1、c-Myc和CDK4,结果表明,其mRNA和蛋白质水平随着β-catenin蛋白降低而表达下调。同时,也检测到其它与Wnt/β-catenin蛋白途径相关的基因,如SFRP2、SFRP5、E-cadherin、GSK3-β、p-GSK3-β和BCL-2,结果显示E-cadherin、p-GSK3-β和SFRP5表达上调,但BCL-2的表达下调,GSK3-β和SFRP2的表达无明显变化。总之,这些结果表明,β-catenin蛋白可能作为miR-24-1-5p的直接靶标,除β-catenin蛋白外,与β-catenin蛋白信号通路相关的基因也可以通过miR-24-1-5p调节。本实验研究结果表明miR-24-1-5p可能是结直肠癌抑制因子,在肠癌发生过程中,miR-24-1-5p参与Wnt/β-catenin信号通路,通过对靶基因β-catenin的抑制,进而调控通路下游cyclinD1、c-Myc、CDK4、SFRP2、SFRP5、E-cadherin、GSK3-β、p-GSK3-β和BCL-2等癌相关基因的表达,cyclinD1、c-Myc和CDK4蛋白表达下调说明miR-24-1-5p抑制结直肠癌细胞的分裂和增殖能力,减少成瘤的可能,BCL-2的变化也展现了miR-24-1-5p促进结直肠癌细胞凋亡,其余相关蛋白的变化验证了miR-24-1-5p抑制肿瘤的作用。说明miR-24-1-5p在结直肠癌调控中的确扮演着重要的作用。