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第一部分IL-23在肝细胞肝癌发展中的作用目的:探究IL-23在体内对肝细胞肝癌发展的影响。方法:构建肝癌模型:(a)取对数生长期的稳转细胞hepa1-6-IL-23(稳定表达IL-23的hepa1-6肝癌细胞系)及对照稳转细胞hepa1-6-vector(仅转染空载体的hepa1-6肝癌细胞系)用PBS制成单细胞悬液(5×105/ml),利用高压水流动力学的注射方法在8-10秒内将细胞通过尾静脉注射到小鼠体内,每只小鼠注射的细胞量为1×106/2 ml,构建原位肝细胞肝癌模型。3周后处死小鼠,取出小鼠肝脏,计录肝脏肿瘤结节数目;(b)提前一周给小鼠喝含抗生素(8万U/250ml)酸性水。取对数生长期的稳转细胞hepa1-6-IL-23及对照稳转细胞hepa1-6-vector用PBS制成单细胞悬液(4×107/ml),利用手术的方法,在超净工作台中,将小鼠腹部剖开一小口,挤出肝脏一叶,用胰岛素注射器吸取细胞缓慢的注射入暴露的肝脏中,再将小鼠伤口缝合,每只小鼠注射的细胞量为1×106/25μl,构建小鼠原位肝癌模型。2周后处死小鼠,解剖取出小鼠肝脏,测量并计算小鼠肿瘤体积;(c)取14天大的C57BL/6小鼠,腹腔注射DEN(25mg/kg)构建原发性原位肝癌模型。从第2个月开始,每两个月采用高压水流动力学的方法注射对照空载体质粒或IL-23微环质粒,10个月后处死小鼠,计录肝脏肿瘤结节数,测量肿瘤体积,并观察不同实验组的小鼠的生存情况。结果:通过不同方法构建的肝癌模型表明IL-23在肝细胞肝癌发展中具有促进作用。在HGT构建的小鼠肝癌模型中,IL-23组小鼠肝脏表面肿瘤结节数目明显多于对照组。通过原位接种的方法模拟了人块状肝癌模型,在此模型中IL-23组小鼠的肿瘤体积明显大于对照组小鼠的肿瘤。除此,在DEN诱导的原发性肝细胞肝癌模型中,IL-23也表现出明显的促进肝细胞肝癌发展的作用。结论:IL-23在体内明显促进肝细胞肝癌的发展。第二部分IL-23依赖于IL-17A途径促进肝细胞肝癌的发展目的:体内实验探究IL-23促进肝细胞肝癌发展的机制。方法:(a)流式细胞术检测肝细胞肝癌发展不同时期的小鼠体内的免疫细胞表型。胞内染色检测脾脏和肝脏中CD4+T以及CD8+T细胞IFN-γ,TNF-α以及IL-17A的分泌水平。(b)使用C ytometric Bead Array(CBA)试剂盒检测小鼠血清中IL-6,IL-9,IL-12,IL-17的含量。(c)采用HGT注射方法和DEN化学诱导方法在野生型小鼠和IL-17A敲基因小鼠上构建小鼠原位肝细胞肝癌模型,确定IL-17A在IL-23介导的促进肝细胞肝癌发展中的作用。结果:流式结果表明IL-23显著促进T细胞分泌IL-17A,并且抑制肿瘤微环境中CD8+T细胞TNF-α的表达。CBA结果表明IL-23可以促进IL-17A的分泌但不影响IL-9的分泌,而且IL-23的过表达不影响IL-12的表达。WT小鼠和IL-17A-/-小鼠的肿瘤结果显示IL-23促进肝细胞肝癌发展的作用在IL-17A敲除后被显著地削弱。结论:IL-23通过调节IL-17A分泌在体内发挥促进肝细胞肝癌发展的作用。第三部分NCR-ILC3在肝细胞肝癌发展中的作用目的:进一步探究IL-17A的来源及ILC3在肝细胞肝癌发展中的作用。方法:(a)流式细胞术检测肝细胞肝癌发展不同阶段小鼠肝脏中的各免疫细胞的IL-17A分泌情况。(b)流式细胞术检测并确定NCR-ILC3细胞的免疫表型。(c)体内注射Ed U实验探索IL-23对NCR-ILC3增殖能力的影响。(d)NCR-ILC3过继输注实验确定NCR-ILC3在肝细胞肝癌发展中的作用。(e)NCR-ILC3与CD4+T细胞,CD8+T细胞,γδT细胞体外共培养实验,检测NCR-ILC3对CD4+T细胞,CD8+T细胞,γδT细胞的增殖,凋亡以及IFN-γ和TNF-α的分泌水平的影响。(f)流式细胞术检测小鼠肝脏中ILC1的比例在正常状态,荷瘤状态以及高表达IL-23的荷瘤状态下的比例变化情况。(g)体外在细胞因子IL-2联合IL-12,IL-1β,IL-23或者IL-1β和IL-23的作用下,检测ILC1向ILC3分化的能力。(h)高压水流注射hepa1-6-vector或hepa1-6-IL-23稳转细胞构建小鼠肝癌模型,并于模型构建当天,过继输注CD45.1-C57BL/6小鼠来源的ILC1,探究IL-23能否在体内促进ILC1向ILC3的分化。结果:流式结果显示在肝细胞肝癌发展早期,IL-23主要促进CD3-细胞分泌IL-17A,在肝细胞肝癌发展中期主要促进γδT细胞和CD4+T细胞分泌IL-17A,到肝细胞肝癌发展后期主要促进CD8+T细胞分泌IL-17A。进一步确定分泌IL-17A的CD3-细胞为NCR-ILC3(CD45+CD3-CD19-NK1.1-CD11b-CD127+RORγt+CD4-Sca1+NKp46-)。体内Ed U实验证明IL-23促进了NCR-ILC3增殖。体内回输NCR-ILC3实验证明了NCR-ILC3能够促进肝细胞肝癌发展。体外NCR-ILC3与CD4+T细胞,CD8+T细胞,γδT细胞共培养实验结果显示NCR-ILC 3可以抑制CD4+T细胞IFN-γ的分泌,以及促进CD8+T细胞的凋亡,抑制CD8+T细胞的增殖以及IFN-γ和TNF-α的分泌。体外ILC1在不同细胞因子联合作用下培养结果显示,IL-23在体外可以促进小鼠ILC1向ILC3分化。ILC1过继输注实验结果显示,IL-23在体内也可以促进ILC1向ILC3分化。结论:IL-23在体内通过促进ILC3增殖,ILC1向ILC3的分化,进而促进NCR-ILC3(肝癌早期)、CD4+T细胞(肝癌中期)及CD8+T细胞(肝癌晚期)分泌IL-17A形成免疫抑制的肿瘤微环境从而促进肝细胞肝癌的发展。