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本文以海产小杂鱼黄鲫为原料,通过蛋白酶切法制备抗菌肽类,研究抗菌作用及其他生物活性,为黄鲫的深加工利用提供理论依据。具体研究内容包括:黄鲫蛋白抗菌肽的制备;黄鲫蛋白抗菌肽的理化性质;黄鲫蛋白抗菌肽的分离纯化;黄鲫蛋白抗菌肽的抑菌模式;黄鲫蛋白抗菌肽及热处理产物抗氧化作用;黄鲫蛋白抗菌肽及热处理产物抗肿瘤作用。
比较黄鲫蛋白风味蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解液的抑菌作用,选用胃蛋白酶为实验用酶,经过响应面分析中心组合设计实验确定了胃蛋白酶水解黄鲫蛋白制备抗菌肽(HAHp)的最佳条件为:酶加入量1100 U/(g底物),反应pH2.0,酶解时间2.4 h,水/底物比值为4。该抗菌肽的可溶性肽提取率为(81.78±0.04)％,水解度(DH)(18.12±0.39)％,凝胶分离结果显示该抗菌肽主要由分子量低于3000 Da的低聚肽组成,具有广谱抑菌作用。
本文测定了黄鲫蛋白抗菌肽HAHp的溶解性、乳化性和发泡性,结果表明在pH值2～12条件下的溶解度达到80％以上,具有一定乳化性和泡沫形成能力。研究了加热温度和时间、酸碱条件、胰蛋白酶和β-内酰胺酶、金属离子、冻融次数对HAHp的抑菌作用影响,实验结果表明HAHp对热较稳定;在pH2.4～9.4下,HAHp均有抑菌活性,但以pH5.4弱酸条件时的抑菌活性最强;HAHp经胰蛋白酶分别水解1～5h后仍表现出抑菌活性;耐受β-内酰胺酶;反复冻融6次后的抑菌活性无显著性改变;一价金属离子K+、Na+、Ca2+和Mg2+不影响HAHp的抑菌活性,但是HAHp与浓度大于2.5 mmol/L的Fe2+和Zn2+作用后,抑菌圈直径显著减小,Fe3+的存在则不利于HAHp抑菌活性保持。
本文采用Sephadex G25凝胶过滤和RP-HPLC分离得到黄鲫蛋白抗菌肽HAHp中的有效抗菌组分HAHp2-3-I,Source5RPC ST柱色谱显示HAHp2-3-I含有具有抑菌活性的2个分离峰。液质联用技术(UPLC-MS)分析得到HAHp2-3-I是由10余条分子量1100～1700 Da小肽组成,鉴定得到MLTTPPHAKYVLQW,SHAATKAPPKNGNY,PTAGVANALQHA,QLGTHSAQPVPF和VNVDERWRKL5条阳离子肽,LATVSVGAVELCY,NPEFLASGDHLDNLQ和PEVVYECLHW3条阴离子肽及LRSKAAAPAEQYE和TPGALLEHPTL2条中性肽。化学合成3条阳离子型肽MLTTPPHAKYVLQW,SHAATKAPPKNGNY和PTAGVANALQHA均能表现出抑菌活性。
采用大肠杆菌生长曲线测定、细胞膜渗透性检测及扫描电镜法探讨黄鲫蛋白抗菌肽的抑菌模式,实验结果表明HAHp和其有效抗菌组分HAHp2-3-I均能有效抑制大肠杆菌的生长繁殖,HAHp能诱导大肠杆菌细胞膜渗透,扫描电镜结果揭示HAHp和HAHp2-3-I对大肠杆菌的菌体细胞膜有损伤作用。nAnp2-3-I中8条荷电肽与UniProtKB/SWISS-PROT和抗菌肽数据库APD中已知抗菌肽序列比对,结果均为新肽。阳离子肽MLTTPPHAKYVLQW、SHAATKAPPKNGNY和PTAGVANALQHA与两栖动物蛙类来源抗茵肽具有较高同源性。HAHp2-3-I中的荷电肽经多层神经网络(HNN)生物软件预测得到α——螺旋、无规卷曲和延展结构构成荷电肽的二级结构。
本文研究发现黄鲫蛋白抗菌肽HAHp经过适当热处理后可以有效提高体外DPPH自由基清除能力,且DPPH自由基清除率与褐变指数在一定范围存在线性关系(y=105.41x+55.036,R2=0.9343)。氨基酸分析显示HAHp热处理产物HAHp-H中游离氨基酸含量显著低于HAHp的游离氨基酸总量,其中半胱氨酸全部损失,赖氨酸含量也降低,但是疏水氨基酸比例则由加热前45.92％提高至加热后48.74％。分子量分布表明热处理提高了HAHp-H中3000～5000 Da和小于500 Da组分含量,体外抗氧化实验结果表明HAHp-H能有效地清除DPPH自由基和羟自由基,并且还原力显著强于HAHp。
本文采用MTT法测定了黄鲫蛋白抗菌肽HAHp和热处理产物HAHp-H体外抑制人前列腺癌DU-145、肺癌1299和食道癌109细胞增殖能力,结果表明HAHp和HAHp-H对前列腺癌DU-145和肺癌1299的抑增殖效果要好于食道癌109。HAHp和HAHp-H抑制前列腺癌细胞DU-145的IC50值分别为41.14mg/mL和13.67mg/mL;抑制肺癌细胞1299的IC50值HAHp和HAHp-H则分别为40.28mg/mL和25.17mg/mL:HAHp和HAHp-H在浓度为40 mg/mL时才表现出对食道癌细胞109增殖抑制作用。而且,HAHp-H对肿瘤细胞增殖抑制率高于同浓度的HAHp。采用细胞形态结构和HE染色法观察到人前列腺癌细胞DU-145与HAHp和HAHp-H作用48h后,细胞形态结构变化明显,出现细胞凋亡特征。