东亚飞蝗谷胱甘肽s-转移酶基因克隆、基因表达及蛋白纯化

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东亚飞蝗是洲际性的农业害虫,其为害严重。近年来我国蝗虫发生逐年加重,特别是由于北方地区持续高温干旱,蝗虫孳生环境变化,蝗灾发生面积扩大,暴发频率提高,对我国农业生产构成严重威胁。我国目前控制蝗虫为害的手段主要是采用化学药剂来降低虫口密度。化学防治虽然具有快速、高效、使用灵活等优点,但是随着农药品种及数量的增加和无限制地使用农药,蝗虫的抗药性增加、农药的效能降低、农药生产成本增加等一系列问题突显。针对以上问题本文以东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis(Meyen))为研究对象,对其三大解毒酶系之一的谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)进行研究,对GSTs进行了纯化、各龄东亚飞蝗GSTs活性比较、基因进行了克隆和序列分析等工作,具体研究内容如下:  通过硫酸铵沉淀技术和GSH-agarose亲和层析对东亚飞蝗五龄若虫GSTs进行了分离纯化。结果表明GSTs活性在硫酸铵各沉淀段均有分布,其中在55%~100%沉淀段活性较高,在硫酸铵饱和度为85%时比活力最高,达到420.33μmol/min/mg protein,纯化倍数为18.86。根据硫酸铵粗沉淀GSTs结果,选择硫酸铵浓度为60%~90%沉淀段进行GSH-agarose亲和层析,纯化后比活力最高达到1365.29μmol/min/mg protein,纯化倍数达到61.25。经SDS-PAGE鉴定,得到的GST为一条带,亚基的分子量约为24kDa。  对东亚飞蝗各龄期GSTs活性进行了比较研究,一龄若虫GSTs的比活力最高,三龄若虫最低。据此推测,东亚飞蝗不同龄期GSTs的活性差异可能是由于各龄期生长发育代谢机能的不同所致。  根据昆虫中已发表的GSTs保守序列设计引物,用RT-PCR方法从东亚飞蝗中克隆出GST基因片段,并通过RACE方法,克隆了东亚飞蝗GST基因全序列。获得的cDNA全长866bp,其中可读框657bp,编码219个氨基酸,5-非翻译区(5-UTR)和3-非翻译区(3-UTR)的长度分别为60bp和149bp。将其氨基酸序列与其它物种的GSTs进行相似性比较,发现此基因为Delta家族的成员,并命名为LmGSTd1。  根据昆虫GSTs氨基酸序列的保守区(motif),采用生物信息学方法对东亚飞蝗表达序列标签(Expressing sequence tags,ESTs)数据库进行了全面搜索,对获得的谷胱甘肽S-转移酶ESTs片段进行拼接、注释,得到10个谷胱甘肽S-转移酶ESTs。采用实时定量PCR技术对这些GST基因和第四章中克隆得到的LmGSTd1基因在黄骅种群和敏感品系中的表达量进行了比较,结果发现,GST基因GST1、GST2、GST3、GST4、GST5、GST6、GST7、GST8、GST9、GST10和LmGSTd1在黄骅种群中的表达量分别是敏感品系的1.25、1.33、2.48、1.17、2.60、3.99、55.88、1.56、3.47、2.27、1.61倍。由此认为,这些GST基因的表达提高与东亚飞蝗的抗药性密切相关。  将黄骅种群和敏感品系中表达差异倍数大于2的基因,即GST3、GST5、GST6、GST7、GST9、GST10以及LmGSTd1使用半定量RT-PCR的方法进行了前肠、中肠、后肠、头、胃盲囊、脂肪体、马氏管、表皮等不同组织部位表达情况的比较。结果发现,不同的基因在同一品系组织部位间的表达量差异较大,且相同基因在两种群中表达有差异。RT-PCR结果表明,LmGSTd1基因在东亚飞蝗敏感品系5龄若虫的8个组织中都有表达,前肠和马氏管的表达量较低,其它各组织部位间没有明显差异。而在黄骅种群样本的后肠和马氏管表达量显著低于其它组织部位。GST7基因在两种群间的表达量差异较大,在黄骅种群前肠、中肠、后肠和胃盲囊中有表达,尤以中肠和胃盲囊表达量最高。在敏感品系中除头、脂肪体和表皮以外其他部位均有表达,且在中肠、后肠和胃盲囊中表达量较高。总之,东亚飞蝗各个组织中均有GST基因的表达,但所表达的GST基因的类型有所差异。
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