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研究目的:
肠易激综合征是一种表现特征为慢性腹痛、肠道运动功能紊乱、无明显的肠道功能指标异常、疼痛随排便过程加重等慢性胃肠道功能性疾病，目前其病因尚不明确，研究进展比较缓慢。最近的研究表明，表观遗传学调控如microRNA的调节在慢性疼痛的发展中起着重要的作用。本研究的目的是确定miR-325-5p在慢性内脏痛大鼠模型中的作用及其机制。
实验方法:
1.给出生10d的雄性SD大鼠结肠注射0.2mL的0.5％稀乙酸建立新生期结肠炎性刺激(Neonatal Colonic Inflammation，NCI)导致成年大鼠慢性内脏痛的动物模型。待大鼠成年(6周)后，通过检测大鼠的结肠扩张阈值(Colorectal Distention，CRD)来判定NCI大鼠的疼痛行为反应。
2.RT-PCR方法检测miR-325-5p和趋化因子2(C-C motif ligand 2，CCL2)在不同时间点的mRNA表达水平;Westernblot技术检测CCL2的蛋白表达水平。
3.鞘内注射miR-325-5p-agomir过表达miR-325-5p后检测NCI大鼠的内脏痛行为反应。
4.鞘内注射CCL2的拮抗剂Bindarit后检测NCI大鼠的内脏痛行为反应。
5.免疫荧光技术检测CCL2在结肠相关(T13-L2)背根神经节(dorsal root ganglion，DRGs)神经元中的定位。荧光原位杂交(FISH)技术检测miR-325-5p在大鼠T13-L2DRGs中的定位情况及其与趋化因子CCL2的共定位情况。
实验结果:
1.NCI导致miR-325-5p在四周龄到八周龄大鼠的结肠相关DRGs中的表达显著降低。
2.与注射agomir-NC组相比，NCI大鼠鞘内注射miR-325-5p-agomir后0.5h到2h时CRD显著增高。
3.NCI显著上调结肠相关DRGs中CCL2的mRNA和蛋白表达水平。
4.CCL2在NeuN阳性DRGs神经元中共表达，而在GS阳性胶质细胞中不表达。此外，CCL2主要表达于IB4和CGRP阳性的DRGs神经元中，少数表达于NF-200阳性的DRGs神经元中。
5.鞘内注射CCL2抑制剂Bindarit10μM后2h时显著提高NCI大鼠的CRD阈值，且抑制作用至少持续到1d。
6.MiR-325-5p与CCL2在结肠相关DRGs中共表达于NeuN标记的神经元中。
7.鞘内注射miR-325-5p-agomir明显抑制了NCI大鼠结肠相关DRGs中CCL2的表达。
实验结论:
NCI大鼠结肠相关DRGs中miR-325-5p表达下调，从而导致CCL2的表达增加，进而介导NCI大鼠的慢性内脏痛敏反应。本研究为miR-325-5p-CCL2信号通路作为治疗IBS慢性内脏痛的靶点提供了理论依据。
肠易激综合征是一种表现特征为慢性腹痛、肠道运动功能紊乱、无明显的肠道功能指标异常、疼痛随排便过程加重等慢性胃肠道功能性疾病，目前其病因尚不明确，研究进展比较缓慢。最近的研究表明，表观遗传学调控如microRNA的调节在慢性疼痛的发展中起着重要的作用。本研究的目的是确定miR-325-5p在慢性内脏痛大鼠模型中的作用及其机制。
实验方法:
1.给出生10d的雄性SD大鼠结肠注射0.2mL的0.5％稀乙酸建立新生期结肠炎性刺激(Neonatal Colonic Inflammation，NCI)导致成年大鼠慢性内脏痛的动物模型。待大鼠成年(6周)后，通过检测大鼠的结肠扩张阈值(Colorectal Distention，CRD)来判定NCI大鼠的疼痛行为反应。
2.RT-PCR方法检测miR-325-5p和趋化因子2(C-C motif ligand 2，CCL2)在不同时间点的mRNA表达水平;Westernblot技术检测CCL2的蛋白表达水平。
3.鞘内注射miR-325-5p-agomir过表达miR-325-5p后检测NCI大鼠的内脏痛行为反应。
4.鞘内注射CCL2的拮抗剂Bindarit后检测NCI大鼠的内脏痛行为反应。
5.免疫荧光技术检测CCL2在结肠相关(T13-L2)背根神经节(dorsal root ganglion，DRGs)神经元中的定位。荧光原位杂交(FISH)技术检测miR-325-5p在大鼠T13-L2DRGs中的定位情况及其与趋化因子CCL2的共定位情况。
实验结果:
1.NCI导致miR-325-5p在四周龄到八周龄大鼠的结肠相关DRGs中的表达显著降低。
2.与注射agomir-NC组相比，NCI大鼠鞘内注射miR-325-5p-agomir后0.5h到2h时CRD显著增高。
3.NCI显著上调结肠相关DRGs中CCL2的mRNA和蛋白表达水平。
4.CCL2在NeuN阳性DRGs神经元中共表达，而在GS阳性胶质细胞中不表达。此外，CCL2主要表达于IB4和CGRP阳性的DRGs神经元中，少数表达于NF-200阳性的DRGs神经元中。
5.鞘内注射CCL2抑制剂Bindarit10μM后2h时显著提高NCI大鼠的CRD阈值，且抑制作用至少持续到1d。
6.MiR-325-5p与CCL2在结肠相关DRGs中共表达于NeuN标记的神经元中。
7.鞘内注射miR-325-5p-agomir明显抑制了NCI大鼠结肠相关DRGs中CCL2的表达。
实验结论:
NCI大鼠结肠相关DRGs中miR-325-5p表达下调，从而导致CCL2的表达增加，进而介导NCI大鼠的慢性内脏痛敏反应。本研究为miR-325-5p-CCL2信号通路作为治疗IBS慢性内脏痛的靶点提供了理论依据。